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南方根结线虫危害多种作物,南方根结线虫病害在全世界范围内造成重大的经济损失。研究南方根结线虫与寄主作物互作的相关机制,对制定更有效的防治措施具有重要的理论意义。SWEET糖转运蛋白家族具有转运糖的功能,参与多种病原微生物与植物互作过程。本文通过南方根结线虫侵染拟南芥试验、实时荧光定量PCR试验、GUS和YFP标记等相关试验研究了拟南芥SWEET糖转运蛋白在南方根结线虫侵染过程中的响应情况,利用酵母单杂交方法筛选了南方根结线虫体内与拟南芥植物AtSWEET1基因互作的蛋白质,并分析了其功能。另外,通过实时荧光定量PCR试验分析了大豆SWEET糖转运蛋白家族基因在南方根结线虫侵染过程中的变化情况。具体研究结果为:1.SWEET糖转运蛋白家族基因在南方根结线虫与拟南芥和大豆互作中的表达变化:拟南芥的SWEETs糖转运蛋白家族有17个成员,根据酸性品红根染色的结果,接种南方根结线虫6天的时候,在拟南芥体内线虫处于在向取食位点移动的阶段,有一部分已经建立了取食位点;接种南方根结线虫12天的时候,侵入的线虫发育至“腊肠状二龄幼虫(Sausage-J2)”阶段;接种南方根结线虫18天的时候,线虫发育至“球形线虫(Globose)”阶段。根据qPCR结果,在接种后第一天,AtSWEET4、AtSWEET6和AtSWEET12诱导表达,其中AtSWEET4的表达量最高,为对照组表达量的12.87倍;在接种后第3天,AtSWEET2、AtSWEET3、AtSWEET5、AtSWEET10和AtSWEET12被诱导表达,其中AtSWEET5的表达量达到对照组表达量的29倍;在接种后第6天,AtSWEET2、AtSWEET5和AtSWEET12的表达被诱导,AtSWEET5的表达量为对照组的6.86倍为其中最高的;在接种后第12天,除AtSWEET1和AtSWEET15外,拟南芥其他15个SWEET糖转运蛋白基因的表达量都下调表达;在接种后第18天,AtSWEET1、AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET6、AtSWEET9和AtSWEET10的表达量上调,其中AtSWEET4的表达量最高,是对照组表达量的27.51倍。大豆有52个SWEET糖转运蛋白,根据次氯酸钠-酸性品红根染色的结果,接种南方根结线虫第1天时,线虫开始侵入大豆根;接种第3天时,线虫在线虫根内部迁移;接种第6天时,线虫形体增粗,建立取食位点并且所在位置附近根部肿大;接种第12天时,多数线虫发育至“腊肠状二龄幼虫(Sausage-J2)”阶段;接种南方根结线虫第18天时,线虫发育至“球形线虫(Globose)”阶段;接种第24天时,根内出现雄成虫;在接种第30天时,拍摄到雄虫离开根组织的照片。根据qPCR结果,大豆根内的SWEET糖转运蛋白基因的表达量在接种后的不同取样时间点具有不同程度的改变,同时检测了接种南方根结线虫后的大豆茎、叶、花、豆及豆荚的表达量变化,35个基因得相对表达量有不同程度的变化。2.南方根结线虫在拟南芥根中的侵染和发育情况:在南方根结线虫侵染拟南芥突变体atsweet10a、atsweet11a、atsweet12b、atsweet13a、atsweet14a、atsweet15d、atsweet11a12b、atsweet12b15d和atsweet11a12b15d第18天时,通过次氯酸钠-酸性品红根染色方法分析南方根结线虫在拟南芥根中的侵染和发育情况。在突变体植株中,线型二龄幼虫和腊肠状二龄幼虫的比例比对照组高,而球形幼虫所占比例比对照组低。突变体植株atsweet10a、atsweet12b、atsweet15d、atsweet12b15d和atsweet11a12b15d上的根结数量较对照组相比极显著降低,atsweet11a和atsweet11a12b上的根结数量较对照组相比降低,差异显著。GUS染色和激光扫描共聚焦显微镜拍摄atsweet11a、atsweet12b和atsweet15d基因融合YFP蛋白植株,在根结附近atsweet11a、atsweet12b和atsweet15d基因较其他部位具有明显的表达。3.线虫中与拟南芥AtSWEET1基因启动子互作的蛋白筛选情况:通过酵母单杂交试验,筛选出26个酵母单克隆,从中获得11条与拟南芥AtSWEET1基因互作的线虫蛋白序列,利用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线软件以及WormBase(https://wormbase.org/#012-34-5)数据库分析,预测Mi-7、Mi-8、Mi-10和Mi-19可能为分泌蛋白。综上,南方根结线虫侵染植物的过程中,引起了植物体内SWEET糖转运蛋白基因的表达量变化,特别是在根结线虫侵染形成的根结部位表达量明显增高。预测线虫中有相关蛋白与拟南芥AtSWEET1基因启动子互作,参与线虫与拟南芥的互作反应。