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肝癌是最常见的恶性肿瘤类型之一,其高转移、高复发的特性,造成肝癌中晚期患者极高的致死率。有研究表明,肝癌细胞表面糖链末端的唾液酸修饰水平会发生显著提升。唾液酸是一种常见的九碳糖,在多种类型的肿瘤中,唾液酸的含量、连接方式等都会发生各种不同程度的改变,而肿瘤细胞的这种唾液酸化状态的改变,可以进一步引起细胞迁移运动能力、与血管内皮结合能力等细胞特性的改变,从而促进转移瘤形成,导致预后变差。唾液酸含量在哺乳动物中主要受到唾液酸转移酶和唾液酸酶的共同调控,其中唾液酸酶主要负责切除糖链上的唾液酸,其表达和功能受到广泛关注。NEU4是唾液酸酶家族的重要成员之一,在肝脏中有着较高的表达水平。已有研究表明,NEU4通过神经节苷脂组分的调控,参与神经元细胞凋亡。在肝癌组织和细胞中,NEU4的表达量会发生显著的下调。但对于NEU4在肝癌细胞中的功能却未见报道。本研究利用TCGA和GTEx公共数据库,对肝癌临床组织样本中NEU4的表达谱数据进行分析,发现NEU4在肝癌中表达显著降低（p＜0.05）。Kaplan-Meier Plotte也显示,NEU4低表达的肝癌患者预后较差。在此基础上,利用q RT-PCR和Western Blot分析肝癌患者临床组织样本中NEU4的表达量,发现NEU4在肝癌中的表达水平显著低于相应的癌旁组织（p＜0.05）。同时165对肝癌组织芯片的免疫组化结果也证实NEU4在肝癌中表达显著下降（p＜0.0001）,并且NEU4表达水平与肝癌临床分期、总生存期、无病生存期等预后指标有关,NEU4表达水平更低的肝癌患者具有更差的预后。这些结果均表明NEU4在肝癌中表达下调,并且与肿瘤的发生发展密切相关。为了探索肝癌细胞中NEU4低表达的调控机制,本研究以NEU4低表达的SK-Hep1作为细胞模型开展研究,发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理可以显著增加NEU4在肝癌细胞中的表达（p＜0.05）。特异性组蛋白去乙酰化酶抑制剂和HDAC1、HDAC2的si RNA处理SK-Hep1和MHCC-97H细胞的实验结果也提示,HDAC1和HDAC2对NEU4表达有负调控作用。Ch IP实验进一步表明,SK-Hep1细胞中NEU4启动子区可以结合H3K9ac和H3K27ac,表明在肝癌中NEU4的低表达受到HDAC1和HDAC2引起的H3K9ac和H3K27ac乙酰化水平降低的调控。在此基础上,我们对NEU4在肝癌细胞中的功能进行深入研究,以NEU4过表达的SK-Hep1、MHCC-97H和HUH7肝癌细胞系为材料,通过划痕实验、细胞小室实验和细胞外基质组分模型matrigel粘附实验,发现NEU4的外源表达可以显著抑制肝癌细胞迁移侵袭能力、促进肝癌细胞对matrigel的粘附能力（p＜0.05）。同时,Tet-on系统的回复实验也证实NEU4对肝癌细胞迁移能力的抑制作用。本研究进一步利用实验性肺转移的裸鼠模型,通过小动物活体成像系统检测、组织形态学观察和组织切片HE染色实验,发现NEU4过表达的肝癌细胞在裸鼠体内肺转移情况显著低于对照组（p＜0.05）。以上研究结果表明,NEU4在体外和体内环境均可以抑制肝癌细胞的迁移运动能力。由于NEU4是一类唾液酸酶,为明确NEU4的酶活对肝癌细胞迁移相关表型的影响情况,本研究检测了NEU4过表达的肝癌细胞系中的唾液酸含量,发现在过表达NEU4的SK-Hep1和MHCC-97H细胞株中,细胞膜唾液酸含量显著下调（p＜0.05）。NEU4激活剂TQ处理SK-Hep1和MHCC-97H后,可以提高NEU4的酶活,并显著抑制肝癌细胞的迁移（p＜0.05）。同时,我们发现并证明NEU4E235位点是NEU4酶活的关键位点,与野生型NEU4相比,过表达失活的NEU4E235A不能抑制肝癌细胞的迁移。同时,分泌型SS-NEU4蛋白胞外孵育能使肝癌细胞膜唾液酸水平和肝癌细胞的迁移率降低（p＜0.05）。以上结果提示,NEU4是通过唾液酸酶的酶活,来实现对肝癌细胞膜表面糖蛋白上唾液酸结构的水解作用,进而抑制肝癌细胞的运动能力。为进一步探讨NEU4对肝癌细胞迁移运动能力抑制作用的具体机制,本研究通过蛋白质免疫共沉淀技术,对SK-Hep1中多聚甲醛固定的NEU4底物进行富集和蛋白质谱鉴定,发现与细胞迁移运动能力相关的高度糖基化的膜蛋白分子CD44是其可能的底物。利用凝集素Blot实验对NEU4过表达的SK-Hep1和MHCC-97H细胞株中CD44的唾液酸修饰情况进行检测,发现NEU4过表达后,膜蛋白CD44糖链上α2,3-连接的唾液酸修饰水平显著降低。同时利用流式细胞技术检测发现,NEU4过表达的SK-Hep1与CD44配体透明质酸结合能力增强（p＜0.01）。在此基础上,在肝癌细胞SK-Hep1和MHCC-97H中过表达CD44糖基化位点突变的CD44m,结果发现与过表达野生型CD44的细胞相比,过表达突变型的CD44m细胞中NEU4激活剂TQ或SS-NEU4的胞外孵育都不能改变肝癌细胞的迁移情况。以上结果表明,NEU4主要是通过切除CD44糖链上的唾液酸,促进肝癌细胞与细胞外基质组分透明质酸的结合,从而抑制肿瘤细胞的迁移运动能力。综上所述,本文研究了唾液酸酶NEU4在肝癌中低表达的机制以及其抑制肝癌细胞迁移的分子机制,其研究结果不仅能够帮助我们更好的了解NEU4在肝癌中的作用、增进唾液酸与肿瘤间关系的认识,更有可能为肝癌这种高转移性的恶性肿瘤提供新的治疗靶标,具有十分重要的意义和临床价值。