新型双水相体系纯化藻红蛋白及其对汞和铜检测的研究

来源 :哈尔滨工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:llqyf
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我国海洋藻类资源丰富,藻类中含有丰富的生物活性物质。其中,条斑紫菜作为一种常见的红藻,含有丰富的高附加值活性物质—R-藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)。目前,R-PE的纯化方法具有操作较复杂、耗时长且得率较低等缺点,这些缺点导致纯化成本较高。基于此,本研究建立了一种使用低共熔溶剂-双水相体系(Deep eutectic solvent-Aqueous two-phase system,DES-ATPS)纯化R-PE的技术,为R-PE的提取纯化领域提供了一种成本较低操作较简单的新方法。将R-PE和R-PE-银纳米颗粒(R-PE silver nanoparticles,R-PE-AgNPs)作为荧光探针应用于检测环境中的金属离子,为该领域提供了天然无毒性且成本较低的新型荧光探针。本论文以条斑紫菜为原料,采用冻融-盐析-ATPS的方法从条斑紫菜中纯化R-PE。首先通过反复冻融法获得了R-PE粗提液,然后经过10%+50%的二步硫酸铵盐析得到透析后R-PE,最后构建DES-ATPS,筛选出Ch Cl-U/K2HPO4作为最优纯化体系并在最优条件下得到了A565/A280为3.83(A565/A280大于3.0,属于药品级)的R-PE,得率达到69.99%,说明纯化效果较好。使用光谱等手段对纯化前后的R-PE进行表征,紫外可见吸收光谱结果表明R-PE的特征峰在495、540和565 nm且纯化前后的R-PE的紫外可见吸收光谱相似;荧光光谱结果表明R-PE的激发波长(Excitation wavelength,Ex)为495 nm,发射波长(Emission wavelength,Em)为570 nm,并且纯化前后的R-PE的荧光光谱相似,以上光谱结果表明R-PE的空间结构保持完好;红外光谱表明纯化前后R-PE的官能团保持完好,结构没有改变;圆二色谱结果表明R-PE的二级结构保持完好。以上结果可以证明该纯化方法的有效性。透射电子显微镜结果说明DES胶束包裹R-PE形成复合物的作用是DES-ATPS纯化的主要驱动力。在上述研究获得了R-PE之后,进一步研究了R-PE在检测金属离子方向的应用。为了建立基于R-PE荧光探针检测金属离子的方法,首先筛选出R-PE对于Hg2+具有较好的选择性且抗干扰性较强,然后对检测条件进行优化并建立标准曲线,计算得出检出限(Limit of detection,LOD)是0.00261 mg/L(0.0130μM)。对自来水和海水(威海)样品中的Hg2+进行检测,得出加标回收率为92.0%~108.0%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)低于1.6%。制备出R-PE荧光检测试纸,它的检测时间为2 min,最低可视化浓度为0.050μM(0.010 mg/L),且可应用于自来水和海水(威海)样品中的Hg2+的检测。对两者之间的荧光猝灭机制进行探究,依据荧光显微镜、荧光寿命等结果可以判断出R-PE与Hg2+之间发生了荧光静态猝灭。通过红外光谱和分峰拟合考察了Hg2+对R-PE二级结构的影响,结果表明Hg2+使R-PE的α-螺旋和无规则卷曲减少,β-折叠和β-转角增多。分子结合位点对接结果表明Hg2+与R-PE单体有两个最优结合位点,分别是位于α链上的78LYS、82CYS,位于β链上的73CYS、82CYS,推测Hg2+与氨基酸中的巯基(-SH)发生了结合。以上结果为Hg2+的快速检测领域提供了一种新的天然荧光探针,并为快速锁定金属离子的浓度范围提供了一种快速便捷的半定量检测工具。采用生物法合成了R-PE-AgNPs实现了对R-PE的修饰和改性。筛选出R-PE-AgNPs对于Cu2+具有较好的选择性,优化检测条件后建立标准曲线,计算得出LOD为0.00122 mg/L(0.0190μM)。将该方法应用于自来水和湖水(威海)样品中Cu2+的检测,得到回收率在91.6%~102.2%,RSD低于1.6%。制备出R-PE-AgNPs荧光检测试纸,它的最低可视化浓度为1.0μM(0.064 mg/L)。作用机制表征结果表明,加入Cu2+后,R-PE-AgNPs出现了明显的聚集且颗粒变大的现象,红外光谱由1647cm-1转移到1641 cm-1处,局域表面等离子体共振峰发生了红移。根据以上结果推断作用机制可能是肽链上的羰基(-C=O)与Cu2+形成了配位复合物,从而发生了荧光静态猝灭。该R-PE-AgNPs丰富了生物法合成的AgNPs的种类,拓展了AgNPs的应用领域,并且所制备的荧光试纸可应用于实地检测水环境中的Cu2+,为快速实地检测Cu2+污染提供了一种便捷的工具。
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