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目的: 构建针对PPARγ基因的重组腺病毒载体 pAdEasy-1-PPARγ-pShuttle-CMV(简写pAd-PPARγ)并对其进行包装,扩增,纯化及滴度检测,为PPARγ参与血管内皮胰岛素抵抗的调控研究奠定基础。 方法: ①HUVECs细胞中提总RNA; ②用全式金逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA; ③PCR扩增目的片段PPARγ; ④构建重组穿梭质粒PPARγ-pShuttle-CMV; ⑤将重组穿梭质粒PPARγ-pShuttle-CMV与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在菌株BJ5183中同源重组; ⑥重组腺病毒载体pAdEasy-1-PPARγ-pShuttle-CMV(pAd-PPARγ)的包装、扩增、纯化及病毒滴度检测; ⑦pAd- PPARγ感染HUVECs后PPARγ表达检测 结果: ①-PCR结果:从HUVECs细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增,在1％的琼脂糖凝胶电泳后在1433bp附近处有亮带,说明成功扩增出PPARγ DNA目的片段; ②重组穿梭质粒PPARγ-pShuttle-CMV酶切鉴定结果:将重组穿梭质粒PPARγ-pShuttle-CMV经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后电泳应在约7500bp位置和约1400bp位置各有一条亮带; ③重组穿梭质粒PPARγ-pShuttle-CMV测序鉴定结果:经测序鉴定,以pShuttle-CMV质粒通用引物为测序引物,共测约1400个碱基,经比对与GenBank上公布的序列一致; ④重组腺病毒载体pAd-PPARγ酶切鉴定:将重组的穿梭质粒PPARγ-pShuttle-CMV与含有腺病毒骨架质粒的pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,经PacⅠ单酶切后电泳条带应在约30Kb和4.5Kb附近有两条带,说明重组成功; ⑤重组腺病毒载体pAd-PPARγ包装与扩增:经PacⅠ限制性内切酶单切pAd-PPARγ,通过脂质体转染法转染至HEK293细胞中进行包装与扩增,得到一定滴度的病毒液,病毒包装成功后,细胞出现病变现象,细胞变圆脱落,出现细胞病变效应(CPE),说明病毒包装基本完成; ⑥重组腺病毒载体pAd-PPARγ病毒滴度检测结果:经扩增纯化,采用TCID50方法检测,其TCID50为10-6.7/mL,达到感染真核细胞标准,病毒滴度较满意; ⑦pAd-PPARγ感染HUVECs后PPARγ表达检测结果:感染了重组腺病毒HUVECs细胞中PPARγ蛋白水平较正常细胞显著上调。 结论: ①测序和酶切结果表明重组腺病毒载体pAd-PPARγ构建成功; ②经包装、扩增和纯化后,其病毒滴度能达到感染真核细胞的要求; ③pAd- PPARγ感染HUVECs后,PPARγ表达水平显著上调。