【摘 要】
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本研究拟为植物转基因提供一种新的工具和策略。通过构建基于外泌体的运输系统来建立一个新的植物转基因体系。CP05是一个由12个氨基酸组成的短肽,能够与外泌体表面的CD63蛋白的膜外大Loop区结合,从而将蛋白负载至外泌体表面,在本研究中构建了pET-28b-CP05-GFP、pET-28b-CP05-Cre和pET-28b-CP05-Tβ4原核表达载体,通过体外重组的方法来表达CP05-GFP（26
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本研究拟为植物转基因提供一种新的工具和策略。通过构建基于外泌体的运输系统来建立一个新的植物转基因体系。CP05是一个由12个氨基酸组成的短肽,能够与外泌体表面的CD63蛋白的膜外大Loop区结合,从而将蛋白负载至外泌体表面,在本研究中构建了pET-28b-CP05-GFP、pET-28b-CP05-Cre和pET-28b-CP05-Tβ4原核表达载体,通过体外重组的方法来表达CP05-GFP（26kDa）、CP05-Cre（37kDa）和CP05-Tβ4（7kDa）蛋白,随后利用考马斯亮蓝染色法检测了CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白的诱导表达及纯化效率。利用流式分析法筛选出了高表达CD63的外泌体,在4℃将CP05-蛋白与外泌体孵育结合6h后,利用Western Blot（WB）及流式分析法检测了二者的结合效率;然后基于结合效率的结果,检测了外泌体的运输效率。提取小麦叶片的原生质体,检测了动物细胞来源的外泌体进入小麦原生质体的能力。为获得蛋白进入细胞的阳性对照,选择Tat细胞穿梭肽,构建了pGEX-6p-1-Tat-GFP原核表达载体,获得了Tat-GFP蛋白,并将其与细胞孵育,获得了蛋白进入细胞的阳性对照。本研究成功构建pET-28b-CP05-GFP、pET-28b-CP05-Cre和pET-28b-CP05-Tβ4原核表达载体,并通过体外诱导表达纯化,获得了CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白;检测了外泌体与CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白的结合效率,并通过WB及激光共聚焦显微镜观察的方法检测了外泌体对CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白的运输效率;成功提取了小麦叶片的原生质体,并检测了动物细胞来源的外泌体进入小麦原生质体的能力;成功构建了pGEX-6p-1-Tat-GFP原核表达载体,通过体外诱导表达纯化及珠上酶切获得了Tat-GFP蛋白,并检测了其进入细胞的能力。本研究获得的主要结果如下:1.通过原核表达系统表达纯化获得了高纯度的CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白;2.通过WB及流式分析法检测了外泌体与CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白的结合效率,实验结果显示:外泌体与CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白均有较强的结合率;3.通过WB及激光共聚焦检测了外泌体对CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白的运输效率,试验结果显示:外泌体不能将CP05-GFP、CP05-Cre和CP05-Tβ4蛋白带至细胞;4.成功获得了小麦原生质体并检测了动物细胞来源的外泌体进入小麦原生质体的能力,试验结果显示:PEG转化GFP质粒后,能够成功表达GFP蛋白,表明原生质体可以用来研究植物跨膜运输;5.通过体外诱导表达纯化及珠上酶切,获得了大小正确且特异的Tat-GFP蛋白,并检测了其进入细胞的能力,试验结果表明:Tat-GFP蛋白能够成功进入细胞。
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