论文部分内容阅读
NADH氧化酶(NOX)是一类催化NADH氧化为NAD+，并消耗O2的氧化还原酶。由于其在维持生物体内NAD+/NADH平衡、辅因子再生和抵抗氧毒害等方面发挥着重要作用，因此受到越来越广泛关注。 本研究克隆出短乳杆菌LactobacillusbrevisATCC367基因组中的NADH氧化酶基因nox，实现了在E.coliBL21(DE3)中的有效表达。在克隆表达的基础之上，为了进一步提高NADH氧化酶活性，本文还对nox进行密码子优化，并建立了密码子优化平台。最后，构建了NADH氧化酶与甘油脱氢酶(GDH)的融合蛋白(GDH-NOX)，进一步探讨此酶在生物催化中的应用。本研究主要包括的内容和结果如下: 一、在E.coliBL21(DE3)实现了NADH氧化酶的异源表达。以LactobacillusbrevisATCC367中相应基因为模板，通过PCR扩增目的基因nox，构建重组表达菌株BL21-pET32a-nox。NOX酶活性最适pH为7.0，最适温度为37℃。测得细胞抽提液中NOX比活性为28.9U/mg，动力学参数Km，和Vmax分别为62.6μM、5.99μM/min。 二、对NOX基因进行密码子优化，提高蛋白表达量。为了提高NOX在E.coliBL21(DE3)中的蛋白表达量，在不改变氨基酸序列的情况下，本文从两个方面对nox进行优化。一方面，利用定点突变技术，提高基因起始密码子下游2-6位密码子AT含量，从而提高目标蛋白的表达量，这可能是由于更易形成结构松散的mRNA，提高翻译起始复合物形成效率。另一方面，从全局出发对整个基因序列进行重新排列，以使得密码子使用频率与E.coliBL21(DE3)基因组密码子使用频率保持一致，从而提高目的蛋白的表达量。实验结果表明，利用定点突变技术局部优化基因结构，细胞抽提液中NOX比活性提高至59.9U/mg，而全序列优化后，细胞抽提液中NOX比活性提高至73.3U/mg。利用制备型液相色谱对细胞抽提液进行纯化，纯化后NOX比活性可达213.8U/mg。 三、构建了NADH氧化酶与甘油脱氢酶的融合蛋白(GDH-NOX)。运用SOE-PCR方法，将甘油脱氢酶基因gdh与NADH氧化酶基因nox融合成一个开放阅读框(ORF)，构建了重组表达质粒pET32a-gdh-nox，并实现了融合酶GDH-NOX在大肠杆菌的成功表达。测得融合酶细胞抽提液对底物甘油和NADH动力学参数分别为:Vmax(Gly)为20μM/min，米氏常数Km(Gly)19.4mM，Vmax(NADH)为12.5μM/min，米氏常数Km(NADH)为51.3μM。为了进一步探讨NOX在生物催化中的应用，分别用大肠杆菌BL21，NOX重组表达菌BL21-pET32a-nox，GDH重组表达菌BL21-pET32a-gdh，GDH-NOX重组表达菌BL21-pET32a-gdh-nox的各细胞抽提液对甘油进行生物转化，结果显示，BL21-pET32a-gdh细胞抽提液催化甘油产DHA，DHA浓度可达172.2mg/L。而含融合酶GDH-NOX细胞抽提液催化甘油产DHA，DHA浓度可达40.1mg/L，这可能是由于融合蛋白对底物具有空间位阻作用。利用BL21-pET32a-nox和BL21细胞抽提液进行催化时，产物浓度均低于25mg/L。