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乳腺是雌性哺乳动物为后代提供乳汁的特有器官。乳腺发育主要分为胚胎期、初情期、妊娠期、泌乳期和退化期等五个阶段。其中，初情期是乳腺发育的关键时期，初情期乳腺的发育状况对泌乳期乳腺的泌乳能力有决定性影响。硫化氢（H2S）是机体一种重要的信号分子，已被证明在心血管、神经、呼吸、胃肠道、肝脏和内分泌等系统都具有重要的调控作用；同时，H2S也是影响畜禽健康的一种重要的环境因子。迄今，环境中的H2S对动物乳腺的发育有何影响尚无报道，其作用机制也有待揭示。本研究包括以下五部分：
第一部分：猪乳腺上皮细胞 (PMECs)的分离、培养、纯化和鉴定
试验采用胰蛋白酶消化和差速贴壁法，从9月龄未妊娠母猪乳腺组织中分离纯化出乳腺上皮细胞，以 CK18 作为乳腺上皮细胞的标志性蛋白，以波形蛋白作为成纤维细胞的标志性蛋白，通过免疫细胞化学和Western blot检测细胞纯度。用CCK8试剂盒测定其生长曲线。结果显示，纯化后的乳腺上皮细胞培养四天后细胞进入对数生长期，可以用于后续试验。
第二部分：外源性H2S对PMECs增殖的影响及其作用机制
为研究H2S对PMECs增殖的影响，试验采用不同浓度（0，10，20，50，100，200，400和600μM）的NaHS（H2S的供体）处理PMECs细胞。结果表明，10~200 μM NaHS显著促进细胞增殖，而600 μM NaHS则显著抑制细胞增殖。表明不同浓度的H2S对PMECs的增殖具有双向调控作用。
为了进一步研究其作用机制，试验采用EdU染色和流式细胞术分析处于S 期细胞的阳性率及PI指数，采用western blot和RT-PCR检测细胞增殖基因及信号通路蛋白的表达。结果表明，10μM NaHS促进S期细胞的阳性率及PI指数；促进增殖基因Cyclin D3、Cyclin A2、Cyclin E2、PCNA的表达，抑制p21基因的表达；促进细胞增殖通路PI3K，Akt和mTOR的磷酸化。而600 μM NaHS则效果相反。采用PI3K/Akt和mTOR通路阻断剂的结果表明，阻断PI3K/Akt可逆转10 μM NaHS促进PMECs增殖的作用及mTOR信号通路，阻断mTOR通路可逆转10μM NaHS促进PMECs增殖的作用，但并未阻断PI3K/Akt信号通路。同时发现，转染Akt-CA后逆转了600μM NaHS对PMECs增殖的抑制作用。上述结果说明，外源性H2S 通过调控PI3K/Akt-mTOR信号通路，以及调控增殖基因cyclinA2，cyclinE2，cyclinD1/3，PCNA 及p21的表达，从而发挥对PMECs 增殖的双向调控作用。
第三部分：外源性H2S对初情期小鼠乳腺发育的影响及其作用机制
为了在活体水平上验证外源性 H2S 对初情期小鼠乳腺发育的影响，试验选取 4 周龄C57/BL雌性小鼠，腹腔注射不同浓度的NaHS（3，9和18 mg/kg），隔天注射一次，连续4周。结果表明，9 mg/kg NaHS显著增加了小鼠乳腺TEB（终末乳芽）的数量及乳腺导管分支的数量；促进了乳腺组织中Cyclin D1和PCNA蛋白的表达；提高了PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平；提高了血清中 IGF-1和雌二醇（E2）的含量及肝脏中 IGF-1蛋白的表达；而18mg/kg组则作用相反。鉴于IGF-1主要由肝细胞分泌，而E2主要由卵巢颗粒细胞分泌，试验进一步在HepG2细胞和猪卵巢颗粒细胞（GCs）中加入不同浓度的NaHS，发现其对HepG2细胞IGF-1蛋白表达无显著影响，但10μM和100μM NaHS显著提高HepG2细胞和GCs中IGF-1和E2含量，而600μM NaHS降低HepG2细胞和GCs中IGF-1和E2含量。以上结果表明，外源性H2S 一方面可能通过调控乳腺上皮细胞 PI3K/Akt-mTOR 信号通路，发挥对初情期乳腺发育的双向调控作用，同时还可通过调控IGF-1和E2的分泌，发挥其对乳腺发育的调控作用。
第四部分：月桂酸（Lauric acid）逆转外源H2S抑制PMECs的作用及其机制
为研究营养物质是否可逆转外源性H2S对PMECs增殖的抑制作用？试验筛选和研究了不同脂肪酸对 PMECs 增殖的影响，结果发现：月桂酸和油酸均可促进 PMECs 增殖。进一步将月桂酸和油酸分别与NaHS共处理PMECs，结果表明，月桂酸逆转NaHS抑制PMECs增殖的作用比油酸强。通过CCK8试剂盒和Edu染色等方法，结果显示：20μM月桂酸可逆转600μM NaHS抑制PMECs增殖的作用，同时逆转600μM NaHS抑制增殖蛋白表达和增殖相关通路的效应。基于以上结果，试验采用 SiRNA 干扰脂肪酸受体 GPR84，结果显示：月桂酸逆转600μM NaHS抑制增殖蛋白表达和增殖相关通路蛋白磷酸化的效应消失。由此说明：月桂酸通过激活GPR84发挥其逆转高浓度NaHS抑制乳腺细胞增殖的效应。
第五部分：日粮中添加1%月桂酸逆转外源 H2S 抑制初情期小鼠乳腺发育的作用及其机制
基于第四部分结果，我们在活体水平上做了进一步的验证。同样选用4周龄C57/BL雌性小鼠48只，每组12只。分为空白对照组、月桂酸对照组、NaHS组和NaHS+月桂酸组。空白对照组饲喂基础日粮，且不注射NaHS（腹腔注射生理盐水）；月桂酸对照组在日粮中添加1%月桂酸，不注射NaHS（腹腔注射生理盐水）；NaHS组饲喂基础日粮，且腹腔注射NaHS；NaHS+月桂酸组在日粮中添加1%月桂酸，且腹腔注射NaHS。NaHS的注射剂量为18mg/kg NaHS，隔日一次，试验期4周。
结果表明：与NaHS 组相比，NaHS+月桂酸组显著增加了乳腺TEB的数量和乳腺导管分支，促进增殖蛋白表达及PI3K、Akt 和 mTOR的磷酸化水平。同时，促进血清中IGF-1和E2含量及肝脏中IGF-1蛋白的表达。此外，20 μM月桂酸促进了HepG2细胞和GCs分泌IGF-1和E2，而600μM NaHS则降低了HepG2和GCs分泌IGF-1和E2，二者共处理后，HepG2细胞和GCs分泌IGF-1和E2基本达到对照组水平。
综上所述，本研究结果表明，低浓度H2S激活PI3K/Akt-mTOR信号通路，调控增殖基因cyclinA2，cyclinE2，cyclinD1/3，PCNA及p21的表达，促进PMECs增殖和初情期小鼠乳腺的发育。同时，低浓度H2S促进初情期小鼠肝脏中IGF-1的表达，提高血清中IGF-1和E2的含量，促进小鼠乳腺的发育；而高浓度 H2S 作用则与之相反。月桂酸通过激活 GPR84 和PI3K/Akt-mTOR信号通路，促进增殖基因cyclinA2，cyclinE2，cyclinD1/3，PCNA的表达及抑制p21基因的表达，逆转高浓度 H2S对 PMECs抑制增殖作用及抑制初情期小鼠乳腺发育的作用。同时，月桂酸促进肝脏 IGF-1的表达，提高血清IGF-1和E2的含量，逆转高浓度的H2S 抑制初情期小鼠乳腺发育的作用。上述研究结果不仅可为养殖生产实际中评估环境中的H2S对哺乳动物乳腺发育的影响提供科学依据，而且也为人类环境与健康研究提供重要参考。
第一部分：猪乳腺上皮细胞 (PMECs)的分离、培养、纯化和鉴定
试验采用胰蛋白酶消化和差速贴壁法，从9月龄未妊娠母猪乳腺组织中分离纯化出乳腺上皮细胞，以 CK18 作为乳腺上皮细胞的标志性蛋白，以波形蛋白作为成纤维细胞的标志性蛋白，通过免疫细胞化学和Western blot检测细胞纯度。用CCK8试剂盒测定其生长曲线。结果显示，纯化后的乳腺上皮细胞培养四天后细胞进入对数生长期，可以用于后续试验。
第二部分：外源性H2S对PMECs增殖的影响及其作用机制
为研究H2S对PMECs增殖的影响，试验采用不同浓度（0，10，20，50，100，200，400和600μM）的NaHS（H2S的供体）处理PMECs细胞。结果表明，10~200 μM NaHS显著促进细胞增殖，而600 μM NaHS则显著抑制细胞增殖。表明不同浓度的H2S对PMECs的增殖具有双向调控作用。
为了进一步研究其作用机制，试验采用EdU染色和流式细胞术分析处于S 期细胞的阳性率及PI指数，采用western blot和RT-PCR检测细胞增殖基因及信号通路蛋白的表达。结果表明，10μM NaHS促进S期细胞的阳性率及PI指数；促进增殖基因Cyclin D3、Cyclin A2、Cyclin E2、PCNA的表达，抑制p21基因的表达；促进细胞增殖通路PI3K，Akt和mTOR的磷酸化。而600 μM NaHS则效果相反。采用PI3K/Akt和mTOR通路阻断剂的结果表明，阻断PI3K/Akt可逆转10 μM NaHS促进PMECs增殖的作用及mTOR信号通路，阻断mTOR通路可逆转10μM NaHS促进PMECs增殖的作用，但并未阻断PI3K/Akt信号通路。同时发现，转染Akt-CA后逆转了600μM NaHS对PMECs增殖的抑制作用。上述结果说明，外源性H2S 通过调控PI3K/Akt-mTOR信号通路，以及调控增殖基因cyclinA2，cyclinE2，cyclinD1/3，PCNA 及p21的表达，从而发挥对PMECs 增殖的双向调控作用。
第三部分：外源性H2S对初情期小鼠乳腺发育的影响及其作用机制
为了在活体水平上验证外源性 H2S 对初情期小鼠乳腺发育的影响，试验选取 4 周龄C57/BL雌性小鼠，腹腔注射不同浓度的NaHS（3，9和18 mg/kg），隔天注射一次，连续4周。结果表明，9 mg/kg NaHS显著增加了小鼠乳腺TEB（终末乳芽）的数量及乳腺导管分支的数量；促进了乳腺组织中Cyclin D1和PCNA蛋白的表达；提高了PI3K、Akt、mTOR的磷酸化水平；提高了血清中 IGF-1和雌二醇（E2）的含量及肝脏中 IGF-1蛋白的表达；而18mg/kg组则作用相反。鉴于IGF-1主要由肝细胞分泌，而E2主要由卵巢颗粒细胞分泌，试验进一步在HepG2细胞和猪卵巢颗粒细胞（GCs）中加入不同浓度的NaHS，发现其对HepG2细胞IGF-1蛋白表达无显著影响，但10μM和100μM NaHS显著提高HepG2细胞和GCs中IGF-1和E2含量，而600μM NaHS降低HepG2细胞和GCs中IGF-1和E2含量。以上结果表明，外源性H2S 一方面可能通过调控乳腺上皮细胞 PI3K/Akt-mTOR 信号通路，发挥对初情期乳腺发育的双向调控作用，同时还可通过调控IGF-1和E2的分泌，发挥其对乳腺发育的调控作用。
第四部分：月桂酸（Lauric acid）逆转外源H2S抑制PMECs的作用及其机制
为研究营养物质是否可逆转外源性H2S对PMECs增殖的抑制作用？试验筛选和研究了不同脂肪酸对 PMECs 增殖的影响，结果发现：月桂酸和油酸均可促进 PMECs 增殖。进一步将月桂酸和油酸分别与NaHS共处理PMECs，结果表明，月桂酸逆转NaHS抑制PMECs增殖的作用比油酸强。通过CCK8试剂盒和Edu染色等方法，结果显示：20μM月桂酸可逆转600μM NaHS抑制PMECs增殖的作用，同时逆转600μM NaHS抑制增殖蛋白表达和增殖相关通路的效应。基于以上结果，试验采用 SiRNA 干扰脂肪酸受体 GPR84，结果显示：月桂酸逆转600μM NaHS抑制增殖蛋白表达和增殖相关通路蛋白磷酸化的效应消失。由此说明：月桂酸通过激活GPR84发挥其逆转高浓度NaHS抑制乳腺细胞增殖的效应。
第五部分：日粮中添加1%月桂酸逆转外源 H2S 抑制初情期小鼠乳腺发育的作用及其机制
基于第四部分结果，我们在活体水平上做了进一步的验证。同样选用4周龄C57/BL雌性小鼠48只，每组12只。分为空白对照组、月桂酸对照组、NaHS组和NaHS+月桂酸组。空白对照组饲喂基础日粮，且不注射NaHS（腹腔注射生理盐水）；月桂酸对照组在日粮中添加1%月桂酸，不注射NaHS（腹腔注射生理盐水）；NaHS组饲喂基础日粮，且腹腔注射NaHS；NaHS+月桂酸组在日粮中添加1%月桂酸，且腹腔注射NaHS。NaHS的注射剂量为18mg/kg NaHS，隔日一次，试验期4周。
结果表明：与NaHS 组相比，NaHS+月桂酸组显著增加了乳腺TEB的数量和乳腺导管分支，促进增殖蛋白表达及PI3K、Akt 和 mTOR的磷酸化水平。同时，促进血清中IGF-1和E2含量及肝脏中IGF-1蛋白的表达。此外，20 μM月桂酸促进了HepG2细胞和GCs分泌IGF-1和E2，而600μM NaHS则降低了HepG2和GCs分泌IGF-1和E2，二者共处理后，HepG2细胞和GCs分泌IGF-1和E2基本达到对照组水平。
综上所述，本研究结果表明，低浓度H2S激活PI3K/Akt-mTOR信号通路，调控增殖基因cyclinA2，cyclinE2，cyclinD1/3，PCNA及p21的表达，促进PMECs增殖和初情期小鼠乳腺的发育。同时，低浓度H2S促进初情期小鼠肝脏中IGF-1的表达，提高血清中IGF-1和E2的含量，促进小鼠乳腺的发育；而高浓度 H2S 作用则与之相反。月桂酸通过激活 GPR84 和PI3K/Akt-mTOR信号通路，促进增殖基因cyclinA2，cyclinE2，cyclinD1/3，PCNA的表达及抑制p21基因的表达，逆转高浓度 H2S对 PMECs抑制增殖作用及抑制初情期小鼠乳腺发育的作用。同时，月桂酸促进肝脏 IGF-1的表达，提高血清IGF-1和E2的含量，逆转高浓度的H2S 抑制初情期小鼠乳腺发育的作用。上述研究结果不仅可为养殖生产实际中评估环境中的H2S对哺乳动物乳腺发育的影响提供科学依据，而且也为人类环境与健康研究提供重要参考。