研究背景及目的脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）是缺血性卒中治疗期间的继发性损伤,可诱发兴奋性毒性、氧化应激、炎症反应等一系列病理变化,最终导致不可逆转的脑损伤。减轻CIRI对改善缺血性卒中的治疗至关重要,然而目前临床上可用于CIRI治疗方法的却十分有限。神经酰胺（ceramide,Cer）作为体内一种关键的生物活性脂质和第二信使物质,其在CIRI发病机制中的作用也引起了相当多的关注。近年来研究表明,神经酰胺及代谢途径中的相关的关键酶参与了脑缺血过程中的多个环节,并在脑缺血的发展过程中发挥着重要作用。芒柄花黄素（formononetin,Form）是红三叶草、鸡血藤、黄芪等多种中草药的主要活性成分,研究已证明Form具有显著的抗CIRI的神经保护作用。在CIRI治疗方面,Form对Cer的调节作用尚不清楚。本研究拟通过探讨Cer在脑缺血再灌注损伤大鼠脑皮层组织中的变化趋势,为进一步研究Form治疗CIRI的机制提供实验和理论基础。方法1.选取成年雄性SD大鼠,每组20只,体重为220～240g,随机分为假手术组（Sham组）,脑缺血再灌注组(MCAO/R组,芒柄花黄素低剂量组（25mg/kg Form组）,芒柄花黄素高剂量组（50mg/kg Form组）,多球壳菌素阳性药组（0.3 mg/kg Myriocin组）。除假手术组外其他各组均采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）损伤模型;2.通过Longa法进行神经功能学评分,TTC染色法观察脑梗死体积,尼氏染色观察大脑皮层组织病理组织学变化,TUNEL染色观察梗塞灶周围神经元凋亡情况,评价芒柄花黄素对MCAO/R大鼠的整体药物作用效果;3.采用酶联免疫吸附法（ELISA）和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术定量各组大鼠脑皮层组织中神经酰胺的含量,观察芒柄花黄素对总神经酰胺及不同碳链长度神经酰胺含量的影响;4.采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术和蛋白免疫印迹（Western Blot）技术分别检测神经酰胺合酶（ceramide synthase,CerS）基因和蛋白水平的表达情况,探究芒柄花黄素抑制神经酰胺的作用机制。结果1.构建大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型后,通过神经行为学评分,TTC染色,尼氏染色及TUNEL染色观察到芒柄花黄素低、高剂量组和阳性药组可显著降低大鼠神经行为学评分,脑梗死和脑水肿体积,神经元坏死及凋亡。2.与假手术组大鼠相比,MCAO/R大鼠脑皮层组织中总神经酰胺含量升高,芒柄花黄素低、高剂量组可显著降低MCAO/R大鼠脑皮层组织中总神经酰胺的含量,且具有剂量-效应依赖性（P＜0.05）。3.基于UPLC-MS/MS技术对神经酰胺定性定量分析结果显示不同碳链长度神经酰胺在脑缺血再灌注损伤组织中呈现不同的变化趋势。与假手术组比较,模型组大鼠脑皮层组织中C16:0-Cer、C18:0-Cer的水平增高,而C24:0-Cer、C24:1-Cer的水平降低,C20:0-Cer、C22:0-Cer的水平在各组间没有显著变化。芒柄花黄素低剂量组可显著改善MCAO/R大鼠脑皮层组织中C16:0-Cer、C18:0-Cer的紊乱,芒柄花黄素高剂量组可显著改善发生C16:0-Cer、C18:0-Cer、C24:0-Cer和C24:1-Cer的紊乱,差异具有统计学意义（P＜0.05）。4.通过对CerS1-6合酶的基因和蛋白水平检测结果显示,C16:0-Cer的升高是由于CerS5的蛋白的高表达,C24:0-Cer和C24:1-Cer的降低是由于CerS2的蛋白的低表达。芒柄花黄素给药后可通过抑制CerS5的表达从而降低C16:0-Cer的水平（P＜0.05）。这一结果证实神经酰胺从头合成通路在芒柄花黄素抗脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用,抑制特异性神经酰胺合酶的表达水平可能成为芒柄花黄素抗脑缺血再灌注损伤的有效途径之一。5.芒柄花黄素可通过降低鞘磷脂水解通路中酸性和中性鞘磷脂代谢酶的基因和蛋白表达从而改变C18:0-Cer的水平。这一结果证实鞘磷脂代谢通路在芒柄花黄素抗脑缺血再灌注损伤也发挥重要作用,抑制鞘磷脂酶的表达水平可能成为芒柄花黄素抗脑缺血再灌注损伤的有效途径之一。结论芒柄花黄素对MCAO/R大鼠模型具有显著神经保护作用,其作用机制与调节神经酰胺代谢通路关键酶的表达,从而改变不同碳链长度神经酰胺的水平有关。