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目的:血管钙化是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)、高血压、血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病中普遍存在的病理表现。其主要特征是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)向成骨样表型(osteoblast-like phenotype)转化,骨基质相关蛋白如骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等表达增加。近年的一些研究表明,自噬过程对于血管钙化的发生发展具有明显的抑制作用,在磷酸盐诱导的VSMC钙化模型中,自噬诱导剂丙戊酸可以减少血管钙化,而自噬抑制剂3-MA能够促进钙化。但是,自噬抑制血管钙化发生发展的机制研究目前尚不清楚。本实验利用小鼠颈总动脉结扎术诱导血管内膜增生模型以及血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)诱导VSMC增殖模型,探讨自噬对VSMC成骨样变的影响及其作用机制。方法:1小鼠内膜增生模型制备与分组选取8~12周的LDLR-/-小鼠,雄性,25只,随机分为3 d、7 d、14 d、28 d和假手术组,异氟烷吸入式麻醉,体式显微镜下行左侧颈总动脉结扎术,假手术组只分离血管,不结扎,分别于结扎术后3、7、14、28 d时生理盐水心脏灌流后取材。将取材的血管分为两部分,一部分用OTC包埋剂包埋、液氮迅速冷冻、冰冻切片,备用;另一部分-80℃保存,Western Blot备用。2 VSMC培养与分组贴块法培养大鼠VSMC,取3-5代细胞进行实验。细胞用无血清DMEM培养24 h后,分别给予PDGF-BB(10 ng/ml)刺激不同时间(6、12、24、48、72 h)后,收集细胞。或者根据实验需要分别给予3-MA(10n M)或雷帕霉素(100n M)预孵育。3 Western Blot分析将收集的血管组织或细胞用RIPA裂解液裂解,提取总蛋白质,Western Blot检测钙化标志蛋白ALP、BMP2以及AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的表达。4冰冻切片免疫荧光染色分析选取结扎不同时间血管组织的冰冻切片,进行组织免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、哺乳动物中ATG6的同源类似物(homolog of ATG6 in mammalian cells,Beclin1)的表达。结果:1内膜损伤后对血管细胞成骨样变和自噬的影响LDLR-/-小鼠结扎不同时间后取材,HE染色结果显示,随着结扎时间的延长,内膜逐渐增厚,管腔狭窄,中膜SMC排列紊乱,I/M比值增加,在结扎28 d时达到高峰。随后检测骨化标志蛋白ALP与BMP2的表达情况,Western Blot结果显示,随着结扎时间的延长,ALP与BMP2的表达均逐渐增加,结扎14 d时达到高峰,28 d有所降低。进一步观察内膜损伤对血管自噬的影响,免疫荧光染色结果显示,随着结扎时间的延长,自噬标志蛋白Beclin1与LC3的表达呈现先增加后降低的趋势,在结扎7 d时达到高峰,28 d恢复到正常水平。2自噬抑制剂3-MA对内膜损伤诱导的血管细胞成骨样变的影响免疫荧光染色结果显示,与结扎组相比,结扎后3-MA孵育组血管中膜Beclin1与LC3的表达均明显减少。Western Blot结果显示,与结扎组相比,结扎后3-MA孵育组血管细胞内ALP与BMP2的表达均明显升高。随后观察了3-MA对内膜增生的影响,HE结果显示,与结扎组相比,结扎后3-MA孵育组血管I/M比值明显升高。3自噬抑制VSMC成骨样变的机制研究用10 ng/m L的PDGF-BB处理VSMC不同时间,Western Blot结果显示,随刺激时间的延长,AMPK的表达增加,24 h达到高峰,72 h仍维持在较高水平。分别用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞后,Western Blot结果显示,3-MA可明显抑制PDGF-BB诱导的AMPK表达,而雷帕霉素可以促进其表达。并且,3-MA可以促进PDGF-BB诱导的ALP活性。结论:1血管内膜损伤后,细胞自噬先被诱导,进而促进血管成骨样变,引起血管内膜增生;2抑制血管细胞自噬可以促进血管钙化与血管内膜增生;3自噬可能通过诱导AMPK的表达,抑制PDGF-BB诱导的VSMC成骨样变。