新型抗肿瘤候选化合物BOC26P的临床前药代动力学研究

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研究背景及目的新型抗肿瘤候选化合物OC26和BOC26P是由天然产物姜黄素作为母体分子设计和合成的邻位芳基查尔酮化合物。OC26是一系列姜黄素衍生物中最有效的化合物。然而,由于其水溶性差和口服吸收低,OC26在结构上被改性为水溶性化合物BOC26P。体外和体内药效学研究已经证实,这两种候选化合物具有显著的抗肿瘤活性,特别是对于耐药的紫杉醇乳腺癌,其靶点是微管蛋白的秋水仙碱结合点。结构修饰的BOC26P目前处于临床前研究阶段,作为一种创新药物,有望在临床实践中用作新的抗肿瘤药物。本研究对BOC26P进行体内外药代动力学研究,为BOC26P的后续制剂研究和临床给药方案设计及联合用药提供依据和指导意义。研究方法本研究首先建立了定量大鼠血浆中BOC26P的UPLC-MS/MS分析方法。该方法具有特异性强、灵敏度高、准确度和可重复性良好的优势,且分析时间短、血浆用量很少,适用于BOC26P的血浆动力学研究和血浆蛋白结合率研究。运用已建立的分析方法,研究大鼠单次尾静脉给药和口服给药的BOC26P血浆动力学研究,结合建立好的校准超滤法测定BOC26P的血浆蛋白结合率。本研究还建立了同时定量BOC26P及其代谢物OC26的HPLC法。该方法可同时定量BOC26P及代谢物OC26,适用于BOC26P的体外代谢研究。在建立好的分析方法的基础上,本研究对BOC26P在SD大鼠、KM小鼠、比格犬、食蟹猴和人肝微粒体中的代谢稳定性差异进行研究,对人肝微粒体代谢酶进行归属。研究结果1 BOC26P不同给药途径的大鼠血药浓度-时间曲线和药代动力学参数计算1.1大鼠血浆中BOC26P的UPLC-MS/MS定量分析方法BOC26P在反相色谱柱Waters XBridge C8 3.5μm上进行分离,质谱检测采用电喷雾离子源,多重反应监测正离子模式(MRM)。定量离子对为428.84→198.92,辅助定性离子对为428.84→224.92,内标选择正离子响应好并与BOC26P提取效率相近的磷酸盐地塞米松磷酸钠(DSP),内标DSP的定量离子对为472.90→434.93,辅助定性离子对为472.90→452.66。样品经甲醇-乙腈(v:v=1:1)法蛋白沉淀,每个样品分析时间3.5 min。BOC26P在大鼠血浆中的线性范围为54.6~2184 ng/m L,标准曲线采用加权最小二乘法进行,加权因子为1/X2,线性回归决定系数R2>0.998,各校准浓度的RSD均<15%。日内准确度为-1.7%~7.1%,日内精密度为1.5%~3.1%,日间准确度为-3.7~6.3%,日间精密度为2.7%~3.1%。大鼠血浆中BOC26P的提取回收率为96.7%~110.5%。经内标校正的基质效应为100.3%~111.5%,且无残留效应。1.2 BOC26P大鼠血药浓度-时间曲线和药代动力学参数计算应用血浆中定量BOC26P的UPLC-MS/MS分析方法,考察单次尾静脉给药的高、中和低浓度三组大鼠和灌胃给药大鼠的血浆动力学特征,计算口服吸收利用度。BOC26P在血浆中的动力学行为与性别无关。其消除受浓度依赖,为酶饱和非线性药代动力学消除。非房室模型分析得出低浓度组半衰期T1/2为0.56±0.07 h(即33.6±4.2 min)、平均滞留时间MRT0-∞为0.40±0.08 h、表观分布容积Vd为0.41±0.17 L/kg和清除率CL为0.51±0.14 L/(kg·h);中浓度组的半衰期T1/2为1.43±0.09 h(即85.8±6.6 min)、平均滞留时间MRT0-∞为0.56±0.09h、表观分布容积Vd为0.74±0.05 L/kg和清除率CL为0.28±0.06 L/(kg·h);高浓度组的半衰期T1/2为1.50±0.12 h(即90±7.2 min)、平均滞留时间MRT0-∞为0.47±0.09 h、表观分布容积Vd为1.68±0.06 L/kg和清除率CL为0.72±0.08L/(kg·h)。二室模型分析得出低浓度组的消除相半衰期T1/2β为0.35±0.08 h(即21±4.8 min)、分布相半衰期T1/2α为0.08±0.09(即4.8±5.4 min)、中央室分布容积V1为0.05±0.06 L/kg和清除率CL为0.12±0.06 L/(kg·h);中浓度组消除相半衰期T1/2β为1.40±0.05 h(即84.0±3.0 min)、分布相半衰期T1/2α为0.14±0.09(即8.4±5.4 min)、中央室分布容积V1为0.08±0.05 L/kg和清除率CL为0.12±0.08 L/(kg·h);高浓度组消除相半衰期T1/2β为1.38±0.06 h(即82.8±3.0 min)、分布相半衰期T1/2α为0.10±0.06(即6±3.0 min)、中央室分布容积V1为0.18±0.08 L/kg和清除率CL为0.21±0.07 L/(kg·h)。2人和大鼠血浆中BOC26P的血浆蛋白结合率研究建立校正超滤法测定BOC26P在大鼠血浆和健康人血浆中的血浆蛋白结合率。结合蛋白和游离药物在Millipore Amicon?Ultra-0.5 10K超滤管上实现分离。将超滤管在5%吐温80中孵育过夜,以降低膜对BOC26P的吸附作用,通过测定药物与超滤管非特异吸附系数校准血浆蛋白结合率的测定。孵育温度为37℃,时间为30 min;离心温度为4℃,转速为13000 r/min,时间为15 min。测得BOC26P在人和大鼠血浆中的血浆蛋白结合率无显著性差异(P>0.05),各浓度组别间结合率也无显著性差异(P>0.05),血浆蛋白结合率为99.43±0.6%。3 BOC26P在肝脏代谢的特性研究3.1肝微粒体中BOC26P和OC26的HPLC定量分析方法BOC26P和OC26在反向色谱柱Waters XBridge C8 3.5μm上进行分离,定量检测波长为354 nm,辅助检测波长为220 nm,分析时间为10 min。BOC26P和OC26的检测专属性良好,大鼠肝微粒体孵育液中,BOC26P的线性范围为10.37~82.96μg/m L,OC26的线性范围为10.27~82.16μg/m L,标准曲线采用最小二乘法进行,线性回归决定系数R2>0.99,各校准浓度的RSD均<15%。孵育液中BOC26P的日内准确度为0.7%~11.6%,日内精密度为0.7%~3.9%,日间准确度为1.6~12.4%,日间精密度为1.7%~6.0%;OC26的日内准确度为-4.4%~9.7%,日内精密度为3.0%~6.7%,日间准确度为-6.9%~11.8%,日间精密度为4.7%~9.9%。孵育液中BOC26P的提取回收率为95.6%~102.5%,OC26的提取回收率为88.5%~103.0%。OC26无残留效应,BOC26P的残留小于LLOQ峰面积的20%。本研究所建立的分析方法符合生物样品分析的要求。3.2 BOC26P在不同种属肝微粒体中的代谢稳定性和种属差异研究BOC26P在人、食蟹猴、比格犬、SD大鼠、KM小鼠肝微粒体体外Ⅰ相代谢系统孵育至270 min,当孵育至90 min时,底物BOC26P的剩余比例分别为19.0±4.1%、0%、38.4±4.7%、57.1±2.9%、61.2±3.3%,半衰期分别为37.66±4.60、25.48±0.56、58.73±6.74、80.58±4.98、111.78±11.76,清除率为0.038±0.005%、0.056±0.002%、0.024±0.004%、0.017±0.002%、0.0128±0.002%。体外代谢半衰期低到高,清除率由高到底均为:食蟹猴、人、比格犬、SD大鼠、KM小鼠,二者五个种属间均具有极显著性差异(P<0.001),其中食蟹猴的代谢最接近人。3.3 BOC26P的CYP450代谢酶表型研究采用选择性化学抑制剂法,通过将人肝微粒体与BOC26P和各CYP450酶抑制剂共同孵育,考察各抑制剂对BOC26P代谢的影响。与阳性对照组相比,CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1的抑制剂均能抑制BOC26P在人肝微粒体中的代谢(P<0.05),其中CYP1A2抑制剂的抑制作用高达60.6%,是BOC26P的主要代谢酶亚型。CYP2A1抑制剂与阳性对照组无显著性差异,因此CYP2A1不参与BOC26P的代谢。研究结论本研究所建立的UPLC-MS/MS和HPLC分析方法符合生物样品分析的要求,已成功应用于BOC26P的药代动力学研究中。BOC26P在血浆中的代谢与性别无关,不受浓度依赖。其半衰期为49 min,在血浆中代谢快,平均滞留时间短,消除快,分布窄,属于快速消除化合物,口服吸收利用度低,血浆蛋白结合率高。BOC26P在肝微粒体中具有极显著的代谢差异,代谢速度食蟹猴>人>比格犬>SD大鼠>KM小鼠,食蟹猴和比格犬的代谢更接近人。在人肝微粒体中代谢酶表型实验证明,CYP3A4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1均参与BOC26P的代谢,其中CYP1A2是BOC26P的主要代谢酶亚型,CYP2A1不参与BOC26P的代谢。
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