【摘 要】
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[目的]阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome,OSAS）是心房颤动（atrial fibrillation,AF）的独立危险因素。间歇性低氧（intermittent hypoxia,IH）是OSAS的主要病理生理特点。IH可激活RhoA/ROCK信号通路影响心血管系统结构功能。缝隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）在调节心肌细胞间
【基金项目】
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国家自然科学基金（81760063）；
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[目的]阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome,OSAS）是心房颤动（atrial fibrillation,AF）的独立危险因素。间歇性低氧（intermittent hypoxia,IH）是OSAS的主要病理生理特点。IH可激活RhoA/ROCK信号通路影响心血管系统结构功能。缝隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）在调节心肌细胞间信号交流、电活动传导起到关键作用,与AF触发和维持密切相关。而RhoA/ROCK信号通路是否可在IH刺激下调节心肌细胞Cx43表达并影响电重构的研究尚无,机制不清。本研究通过构建IH刺激SD大鼠乳鼠原代心房肌细胞模型,模拟OSAS病程中IH对中心房肌细胞的影响,通过形态学观察、分子生物学技术验证IH对心房肌细胞存活率、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor,HIF-1α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）的影响,评价体外模型效果;检测IH条件下,心房肌细胞Cx43表达和RhoA/ROCK信号通路激活情况。随后,利用Y-27632抑制ROCK,验证RhoA/ROCK信号通路对Cx43的调控作用,为进一步探究IH对心房缝隙连接重构的影响,以及此环境下RhoA/ROCK信号通路激活致AF易感的分子机制提供理论依据。[方法]1、分离、纯化、鉴定、培养原代SD大鼠乳鼠心房肌细胞,以5%O230min,20.9%O2 30min为一循环构建不同时长IH刺激（常氧、IH2h、IH4h、IH 6h）的原代心房肌细胞体外模型,使用western blot检测不同IH条件下心房肌细胞cleaved caspase-3和HIF-1α蛋白表达情况,MTS法检测细胞活力情况,评价模型效果。2、使用western blot和q-PCR检测不同时长IH干预下SD大鼠乳鼠心房肌细胞Cx43蛋白和基因表达情况,探讨IH刺激对心房肌细胞缝隙连接重构的影响。3、评价不同时长IH刺激对SD大鼠乳鼠心房肌细胞RhoA/ROCK信号通路的影响,并结合前几部分内容,筛选出施加ROCK抑制剂Y-27632后IH处理时间。检测ROCK-1、MYPT和p-MYPT蛋白表达评价Rho/ROCK信号通路活化情况,检测Cx43蛋白和基因表达水平。[结果]1、随着IH刺激时间延长,心房肌细胞存活率逐渐下降（p<0.05）;HIF-1α表达增加（p<0.001）,呈时间依赖性;cleaved caspase-3表达呈现先升后降的趋势,IH 4h时蛋白表达水平最高（p<0.05）。2、Cx43蛋白和基因表达随IH刺激时间延长逐渐下降（p<0.05）,呈时间依赖性。3、RhoA、ROCK蛋白表达随IH刺激时间延长逐渐增加（p<0.001）。结合细胞活性和各蛋白表达情况,选择4hIH作为施加Y-27632后的处理时间,并分为常氧组、常氧+Y-27632组（常氧+y）、IH4h（IH4）和IH4h+Y-27632（IH4+y）。与常氧组相比,常氧+y组中ROCK-1蛋白表达和p-MYPT/MYPT比值无明显变化,4hIH组中ROCK-1蛋白表达和p-MYPT/MYPT比值明显增加,使用Y-27632可明显降低4h IH刺激下p-MYPT/MYPT比值（p<0.05）。4h IH刺激可明显降低Cx43蛋白表达水平,使用Y-27632使心房肌细胞Cx43蛋白表达呈上升趋势,但无统计学差异;常氧条件下,Y-27632可以增加Cx43 mRNA的表达（p=0.004）。IH 4h刺激可明显降低Cx43基因表达（p<0.001）,使用Y-27632后可逆转IH 4h刺激对Cx43的基因表达的影响,甚至超过常氧下Cx43 mRNA的表达水平（p<0.001）。[结论]1、以5%O230min,20.9%O230min为一循环,可模拟OSAS中间歇性低氧对SD大鼠乳鼠心房肌细胞的损害,为构建OSAS致AF的体外模型提供可能。2、IH可降低SD大鼠乳鼠心房肌细胞Cx43蛋白及其mRNA表达,并呈时间依赖性,可能是IH诱发AF的机制之一。3、IH可激活SD大鼠乳鼠心房肌细胞的RhoA/ROCK信号通路。RhoA/ROCK信号通路可能参与调节IH所致SD大鼠乳鼠心房肌细胞Cx43 mRNA下调,但不是调节Cx43重构的唯一上游。
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