禽致病性大肠杆菌（Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC）是家禽养殖中主要的致病菌,APEC作为肠道外病原菌具有广泛的宿主谱,不仅严重危害养禽业,还对人类健康造成潜在威胁。APEC感染宿主时,生物被膜可抵抗高浓度的抗生素杀伤从而实现其在宿主中持续定殖。此外,当细菌驻留在生物被膜中,会使得细菌的病原相关分子模式较少暴露,有利于其逃脱宿主模式识别受体识别,实现免疫逃避。因此,鉴定参与APEC生物被膜形成的关键基因,解析其调控机制,可为从生物被膜角度开展APEC防控提供理论依据。为了鉴定APEC中参与生物被膜形成和致病性的毒力因子,本研究使用APEC临床分离株APEC81构建转座子随机突变文库,筛选鉴定影响APEC生物被膜形成的基因。共鉴定到30个基因影响生物被膜形成,其中13个是黏附素基因。黏附素是细菌黏附到生物和非生物介质表面形成生物被膜的关键因子,根据其特性和功能分为菌毛黏附素和非菌毛黏附素。所筛选到的黏附素基因中,1型菌毛基因对生物被膜的影响最大,其次为鞭毛基因和Curli菌毛基因。然而有趣的是25℃条件下,菌毛黏附素YbgD缺失导致其生物被膜下降66.06%,推测在25℃环境条件下菌毛黏附素YbgD参与生物被膜形成,增强抵抗外界环境的能力。而在37℃条件下,菌毛黏附素YbgD缺失导致其生物被膜形成增强22.39%,推测其通过生物被膜干扰宿主免疫,参与对宿主的全身感染。在细菌感染时黏附素最早与宿主细胞接触,通过识别细胞表面特异性受体,触发信号通路从而实现定殖和入侵。而大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2（Escherichia coli typeⅢsecretion system 2,ETT2）作为APEC重要的毒力岛,主要作用是调控细菌表面的黏附素参与生物被膜形成和致病性。YbgD作为菌毛黏附素在APEC生物被膜形成和感染宿主过程中的作用以及ETT2作为重要调控系统对YbgD的调控作用尚不清楚。因此本研究首先从病原学的角度分析YbgD菌毛在致病性中的作用,应用转录组分析并验证YbgD菌毛通过介导黏附素Fde C表达参与生物被膜形成和致病性,并且证实了ETT2调节因子Yqe I可以调控YbgD菌毛参与致病过程。其次,从病原与宿主互作角度,通过转录组分析筛选YbgD菌毛在感染宿主细胞过程中激活的信号通路,进一步证实菌毛黏附素YbgD通过调节天然免疫系统介导炎症反应,从而实现对宿主的致病性。本项目通过开展菌毛黏附素YbgD调控APEC生物被膜形成和致病机制研究,可为从生物被膜调控角度开展APEC防控提供理论依据。具体研究内容如下:1、构建转座子随机突变文库筛选鉴定参与APEC生物被膜形成基因首先通过接合转导的方式,将转座子Tn5随机插入到APEC81基因组,并通过抗性筛选和PCR鉴定,成功构建含有6318株突变株的随机突变文库。采用结晶紫染色法从3000株突变株中筛选到45株生物被膜显著下降的突变株,使用交错热不对称PCR（TAIL-PCR）鉴定获得31个插入位点基因。应用Red同源重组方法成功在APEC81上完成31个基因的缺失。由于25℃作为环境温度适合大肠杆菌形成生物被膜抵抗环境压力,而37℃适合大肠杆菌生长有利于合成毒力因子感染宿主。所以在25℃和37℃条件下检测缺失株生物被膜形成能力。结果表明30个基因缺失显著影响生物被膜形成能力,包括鞭毛基因（fli S、fli D、fli R）,Curli菌毛基因（csg D、csg A、csg F、csg G）,菌毛黏附素基因（fim A、fim D、fim C、fim H、ybg D、yeh E）,辅酶基因（glt A、bgl X、mlt F、glx K、suf B、ydc U、ydc V、mdo C、ydi F、pde H、evg S、pfs）,毒素-抗毒基因rat A,假定蛋白基因（07045、11735、11255、03110）。在这些基因中,1型菌毛基因对生物被膜影响最大,鞭毛基因和Curli菌毛基因对生物被膜影响次之。然而25℃条件下,菌毛基因ybg D缺失生物被膜下降66.06%,差异极显著（P＜0.01）;说明在25℃条件下ybg D参与生物被膜形成抵抗外界环境。而在37℃条件下,ybg D缺失使得生物被膜增强22.39%,差异极显著（P＜0.01）,该条件形成生物被膜更利于感染宿主。2、YbgD菌毛介导Fde C黏附素的致病机制研究YbgD菌毛属于分子伴侣/引领蛋白菌毛,为了探究YbgD菌毛的致病机制,通过黏附和侵袭试验发现ybg D缺失显著增强APEC对宿主细胞的黏附和侵袭能力。并且缺失株APEC81Δybg D在宿主细胞内的存活率显著高于比野生株。而APEC81Δybg D对宿主的黏附能力增强作用,不能被甘露糖抑制,表明ybg D对宿主细胞的黏附增强不通过1型菌毛介导,证明有其他黏附素参与。为了筛选YbgD调控的靶基因,通过转录组和实时荧光定量PCR分析发现,缺失株APEC81Δybg D中黏附素基因fde C基因的m RNA水平显著上升。选取黏附素基因fde C作为靶基因,为了验证YbgD与Fde C之间的调控关系,在ybg D基因缺失的基础上进一步缺失fde C基因构建双基因缺失株APEC81Δybg DΔfde C,并进行致病性分析和生物被膜检测。结果表明与APEC81Δybg D缺失株相比,双基因缺失株APEC81Δybg DΔfde C生物被膜形成能力和对宿主细胞的黏附侵袭能力均显著降低（P＜0.05）。此外,通过红细胞凝集试验证明ybg D缺失有利于1型菌毛表达,1型菌毛的表达增强虽然没有介导黏附能力,但是有利于生物被膜形成。本研究表明YbgD菌毛可以通过调节黏附素Fde C和1型菌毛表达参与生物被膜形成和致病过程。3、ETT2转录因子Yqe I调控Ybg菌毛参与致病性研究ETT2毒力岛主要对细菌膜表面黏附素具有调节作用,实验室前期证明ETT2中转录调节因子Yqe I缺失后1型菌毛基因下调导致APEC黏附能力和生物被膜形成能力减弱。为了证明Yqe I与YbgD菌毛的调控关系。通过实时荧光定量PCR检测发现,yqe I缺失后导致Ybg菌毛基因ybg D、ybg Q及ybg P的转录水平显著上调（P＜0.05）,表明Yqe I负调节ybg操纵子。为了验证Yqe I与ybg操纵子之间的调控关系,在缺失株APEC81Δyqe I的基础上进一步构建双基因缺失株APEC81Δyqe IΔybg D、APEC81Δyqe IΔybg Q和APEC81Δyqe IΔybg P。用缺失株进行致病性分析,结果表明与APEC81Δybg D相比,双基因缺失株APEC81Δyqe IΔybg D的黏附能力显著增强（P＜0.05）,加入甘露糖后明显被抑制。与Δybg P相比,双基因缺失株APEC81Δyqe IΔybg P的黏附能力显著增强（P＜0.05）,同样加入甘露糖后明显被抑制,表明APEC81Δyqe IΔybg D和APEC81Δyqe IΔybg P增强1型菌毛表达使得黏附能力增强。进一步利用红细胞凝集试验证明缺失株APEC81Δyqe IΔybg P和APEC81Δyqe IΔybg D中1型菌毛表达显著高于野生株APEC81和缺失株APEC81Δyqe I。同时通过实时荧光定量PCR分析发现,与野生株APEC81相比,缺失株Δyqe I中1型菌毛基因fim A的转录水平显著下调,而缺失株APEC81Δyqe IΔybg P和APEC81Δyqe IΔybg D中1型菌毛基因fim A的转录水平显著上调。表明转录调节因子Yqe I通过负调控Ybg菌毛影响1型菌毛的表达,进而参与致病过程。4、YbgD菌毛与宿主相互作用机制研究菌毛可识别细胞表面的特异性受体,触发信号通路转导从而实现定殖和入侵。已经证明YbgD菌毛缺失导致APEC对宿主细胞黏附侵袭能力增强。为探究YbgD菌毛介导宿主的信号通路。本研究通过RNA-Seq分析野生株APEC81和缺失株APEC81Δybg D感染RAW264.7细胞后的细胞转录组,通过GO功能分析和KEGG富集分析发现差异基因富集在免疫系统过程,涉及的通路有Toll样受体通路、NF-κB信号通路和MAPK信号通路等。通过实时荧光定量PCR检测通路相关基因的转录,缺失株APEC81Δybg D感染宿主细胞后,宿主细胞Toll样受体（TLR3和TRL9）、趋化因子CCL2和炎症细胞因子（IL-1β、TNF-α、IFN-β和IL-6）基因的转录水平显著上调。进一步检测细胞因子水平发现,APEC81Δybg D感染细胞后细胞上清中炎性细胞因子IL-6和IL-1β水平更高（P＜0.05）。感染小鼠发现,缺失株APEC81Δybg D在小鼠的肝、脾、肾和肺中载菌量显著升高（P＜0.05）。并且引起小鼠脾脏肿大,说明小鼠诱发更强的炎症反应。本研究结果表明,YbgD菌毛在感染宿主过程中,介导APEC抑制天然免疫系统中TLR3和TLR9受体的激活,从而抑制炎性细胞因子IL-6和IL-1β的释放,避免炎症反应发生,防止APEC过早被宿主免疫系统清除。综上,本研究通过构建APEC81转座子随机突变文库,筛选鉴定到多个生物被膜形成基因。其中YbgD菌毛可通过抑制1型菌毛和黏附素Fde C的表达,防止APEC对宿主细胞的黏附和入侵增强,从而避免过早激活胞内TLR3和TLR9受体,抑制炎症反应的发生,有利于逃脱宿主的天然免疫实现定殖。并且ETT2毒力岛调控YbgD菌毛参与这个致病过程。表明ETT2毒力岛和YbgD菌毛在逃脱宿主天然免疫系统的识别过程中起到重要作用,本研究为APEC的致病机制提供理论依据。