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比格犬因其性情温顺，体格适中，遗传背景清晰，均质性好，在医药、公共卫生、生命科学和军事医学研究领域，发挥着重要的作用。但目前，我国比格犬种群内的不发情或发情不孕、休情期延长、停发情、窝产仔数少等情况比较常见，严重制约着比格犬的生产效率，因此，针对比格犬生殖调控机理的研究具有重要的理论与实际意义。本研究对不同发情阶段比格犬卵巢与子宫内雌激素受体ERα、ERβ蛋白的表达规律进行了研究，并对犬ERα、ERβ及可能存在的ERβ剪接异构体进行基因扩增，构建真核表达重组质粒，并瞬时转染293T细胞，对其活性进行初步研究。突出的结果是首次发现了比格犬ERβ的四个剪接异构体，为深入进行比格犬ERα、ERβ及其剪接异构体在生殖调控中的作用机制研究奠定了基础。现将实验研究报告如下。1.间情期与发情期比格犬血清性激素检测及卵巢与子宫正常组织形态的比较应用病理切片技术对间情期及发情期比格犬卵巢及子宫的正常组织形态进行比较，并对两个发情阶段比格犬血清性激素：E2、PRGE、FSH和LH水平进行测定，分析其性激素变化特点和卵巢、子宫在不同阶段的组织形态学特征。性激素检测结果表明：在发情期比格犬出现了很明显的E2峰值，而在间情期及发情后期雌激素均维持在极低的水平。而PRGE在间情期未能检测到，在发情期及发情后期均能检出，并且在发情后期表达水平明显升高。组织形态学比较结果表明：间情期犬子宫及其内膜较薄，间质纤维增生，黄体中以初级卵泡为主，可见1-2个次级卵泡，未见成熟卵泡，卵泡和黄体细胞间纤维较多、血管少。发情期犬子宫及其内膜增厚，内膜腺体腔较大，部分腺体呈分枝状弯曲，腺上皮肿大，胞浆淡染，少数可见核下空泡。卵巢中卵泡数量较多，有初级、次级和1-2个成熟卵泡。黄体细胞数量多，排列规则，境界清楚，间质纤维比较疏松，血管多，未见空泡变性。2.间情期与发情期比格犬卵巢与子宫内ERα、ERβ的定位与定量研究运用免疫组织化学和图像灰度分析法对间情期与发情期比格犬卵巢及子宫内ERα、ERβ蛋白的表达进行组织定位和半定量分析，结果如下：⑴比格犬ERα、ERβ的免疫组织化学定位ERα主要表达于卵泡颗粒细胞、卵巢间质腺腺上皮细胞胞核内，胞质内有微弱表达，卵母细胞胞核及卵母细胞胞质内也有表达，在卵泡膜内膜的间质细胞及小动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、小静脉内皮细胞的胞核内也有少量表达。在膜黄体细胞的胞核，颗粒黄体细胞的胞核与胞质内均有表达。ERβ主要表达于卵泡颗粒细胞，卵巢间质腺的腺上皮细胞及颗粒黄体细胞的核膜及胞质内，少量表达于卵巢间质动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、静脉内皮细胞的核膜及胞质内。ERα主要表达于子宫内膜腺体细胞胞核内，而ERβ主要表达于子宫内膜腺体细胞核膜及胞质，在血管内皮细胞及平滑肌细胞胞质内也有表达。BCIP/NBT与AEC双染可见ERα、ERβ在子宫内可表达于同一个内膜腺体细胞，但其定位部位不同：ERα主要在核内，而ERβ主要在核膜及胞质内。⑵ERα、ERβ半定量分析结果间情期与发情期比格犬卵巢内各组成成份ERα蛋白的表达特点：间情期与发情期比格犬卵巢内腺体、卵泡及周围基质、黄体各组份ERα表达的变化以腺体（0.03297±0.004075vs0.06647±0.008961，P＜0.01）和黄体（0.01286±0.003219vs0.06241±0.007671，P＜0.01）为显著，在发情期的表达水平均较间情期显著增加。表明ERα蛋白主要表达于发情期卵巢腺体及黄体内。间情期与发情期比格犬卵巢内各组成成份ERβ蛋白的表达特点：由间情期发展至发情期，比格犬卵巢生长卵泡、初级卵泡、黄体、间质血管各组份中，生长卵泡ERβ表达水平显著增加（0.04471±0.004291vs0.1300±0.03970，P＜0.01），黄体内ERβ表达水平显著下降（0.1515±0.02711vs0.1008±0.02247，P＜0.01），但黄体内ERβ的起始表达水平很高，与初级卵泡及间质血管中的表达水平（0.01879±0.001484）比较仍保持在较高的水平。初级卵泡及卵巢间质血管中ERβ保持在相对较低的水平。表明在卵巢内ERβ蛋白主要表达于生长卵泡及黄体内。间情期与发情期比格犬ERα、ERβ蛋白在卵巢内的表达特点：在间情期及发情期比格犬卵巢内ERβ的表达水平显著高于ERα（间情期：0.08646±0.008002vs0.02398±0.001911，P＜0.01；发情期：0.09007±0.007534vs0.04691±0.003052，P＜0.01）比格犬卵巢内ERα在由间情期发展至发情期时表达水平显著增加（0.02398±0.001911vs0.04691±0.003052，P＜0.01），而ERβ在两个生理阶段基本保持不变（0.08646±0.008002vs0.09007±0.007534，P＞0.05），但与ERα比较，维持在较高的表达水平。说明在间情期与发情期卵巢内均以ERβ的表达占主导地位。间情期与发情期比格犬ERα、ERβ蛋白在子宫内的表达特点：在比格犬子宫内，在间情期，ERα、ERβ都有表达，但都维持在相对较低的水平，并且两者的表达水平无显著差异（0.02855±0.008855vs0.02908±0.003865，P＞0.05），而发展至发情期时， ERα的表达水平显著增加（0.02855±0.008855vs0.04896±0.006833，P＜0.01），ERβ仍维持在相对较低的水平（0.02170±0.003959）。由此得出结论在发情期比格犬子宫内，ERα为优势表达的雌激素受体亚型。3. ERα、ERβ及ERβ新剪接异构体的扩增与鉴定应用RT-PCR扩增了ERα和ERβ的全长编码序列：ERα1791和ERβ1593，并首次筛选出了ERβ的四个选择性剪接异构体：第4外显子完整缺失的一个；第7外显子完整缺失的一个；部分第4和部分第5外显子组合缺失的两个。应用5`3`RACE对第4外显子完整缺失的ERβ1293及第7外显子完整缺失的ERβ1257两个剪接异构体扩增出其全长编码序列。ERα1791分子量为66kD，ERβ1593分子量为59kD；ERβ1293缺失300bp，编码430aa，分子量为48kD；ERβ1257缺失181bp，编码418aa，分子量为47kD，碱基的缺失造成了读码移位，使翻译提前终止，在其终止密码子前插入10个非编码ERβ氨基酸残基。讫今，我们尚未查到关于比格犬ERβ的剪接异构体的研究报道。本实验首次发现比格犬ERβ的四个剪接异构体，扩增出其中两个的全长编码序列，并且证明其在瞬时转染的293T细胞中能够翻译成蛋白质。4. ERα、ERβ及ERβ剪接异构体真核表达重组质粒的构建及活性的初步研究构建了pEGFP-n1-ERα1788，pEGFP-n1-ERβ1590，pEGFP-n1-ERβ1290，pEGFP-n1-ERβ1254真核表达重组质粒，瞬时转染293T细胞，提取细胞总蛋白，经WB验证ERα1788、ERβ1590、ERβ1290、ERβ1254在体外均能翻译成目的蛋白质。