在肿瘤免疫疗法中,Treg细胞是免疫抑制细胞。通常,对Treg细胞进行化学免疫治疗的主要策略是通过化疗药消除Treg细胞。然而,研究发现,死亡的Treg细胞仍能通过核苷腺苷途径发挥免疫抑制作用。为了改善免疫抑制,提高化疗敏感性,我们设计了一个纳米系统递送化学治疗剂和免疫抑制剂,实现免疫化疗的级联增效。合成的化疗药姜黄素类似物(CA-1)被α-乳清蛋白(α-LA)包裹,Treg细胞上表面蛋白特异性抗体(mAb,免疫治疗剂)通过基质金属蛋白酶响应肽(P)与载药蛋白相连。可裂解肽响应基质金属蛋白酶(MMP2)后,将CA-1@α-LA-P-mAb纳米颗粒分离为CA-1@α-LA和抗体mAb两部分,抗体通过Treg细胞特异性受体神经粘蛋白-1(Nrp-1)靶向Treg细胞,胞吞作用使载药蛋白进入癌细胞。乳清蛋白响应细胞内谷胱甘肽(GSH)裂解释放CA-1,进而引发线粒体介导的细胞凋亡。总之,本文将化疗药物和免疫调节剂分别递送至不同的靶细胞内,并对其响应特性、抗血管生成能力及抗肿瘤活性等进行了系统研究。具体研究内容包括以下几方面:1.CA-1@α-LA-P-mAb的制备与表征首先以2-吡啶甲醛和环已酮制备化疗药姜黄素类似物(CA-1),在枯草杆菌蛋白酶(BLP)的作用下将α-乳清蛋白(α-LA)水解,通过二硫苏糖醇(DTT)将蛋白中的二硫键重新交联制备纳米粒。CA-1通过自组装与α-乳清蛋白结合。激光纳米粒度仪和透射电镜分析表明CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统成功制备,平均粒径为175±8.4 nm,平均Zeta电位为-15.03±3.5 mV。2.MMP2/GSH响应性研究通过高效液相色谱仪和透射电镜考察该递药系统对MMP2的酶响应性,MMP2生理浓度下分离为CA-1@α-LA纳米粒和mAb两部分的能力;另一方面,研究GSH存在条件下,α-乳清蛋白响应GSH裂解。结果表明,CA-1@α-LA-P-mAb纳米粒能够响应MMP2/GSH达到程序性释放。3.体外抗肿瘤活性研究及mAb对Nrp-1靶向性研究以小鼠4T1乳腺癌细胞为模型,对CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统的体外抗肿瘤活性进行研究。细胞摄取实验结果表明CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统靶向性良好;细胞毒性实验表明,CA-1与mAb具有协同抗肿瘤作用。细胞内细胞色素C的释放,线粒体膜电位的检测,Western blotting考察线粒体通路级联反应相关蛋白的含量变化,均证明了 CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统能损伤线粒体,引起细胞色素C的释放,从而诱导细胞凋亡。此外,以HUVEC(人脐静脉内皮细胞)为模型,对CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统的生物相容性进行研究,结果表明该系统安全性良好。以DU145(人前列腺癌细胞)为模型,对CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统中mAb对Treg细胞表面蛋白Nrp-1的靶向性进行研究。体外靶向性结果表明,mAb能特异性靶向Nrp-1(神经粘蛋白-1)。4.CA-1@α-LA-P-mAb体内抗肿瘤活性研究以荷4T1乳腺癌的BALB/c雌性小鼠为动物模型,通过考察CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统在小鼠体内的分布,实验组小鼠的相对肿瘤体积变化、H&E染色病理切片、抑瘤率及Tunel染色等结果分析该递送系统的抗肿瘤效果及病理学特性。通过IR783标记空白载体,实验结果表明,CA-1@α-LA-P-mAb纳米递送系统能准确靶向到肿瘤部位,CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统对小鼠肿瘤具有良好的靶向能力。通过药效学,病理学的考察,CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统生物安全性好,给药系统抑制小鼠肿瘤生长效果明显。5.CA-1体外抗血管生成研究以HUVEC(人脐静脉内皮细胞)为模型,考察CA-1@α-LA-P-mAb体外抗血管生成效果。结果表明,合成的化疗药姜黄素类似物CA-1能够使已经生成的血管破裂;另外,对肿瘤组织切片进行免疫荧光染色,通过VEGF的表达考察该纳米递送系统通过降低VEGF的表达,抑制体内肿瘤的转移。6.体内抗转移研究以已形成转移的4T1荷瘤小鼠为模型,对CA-1@α-LA-P-mAb纳米递送系统的体内抗转移效果进行考察。通过研究小鼠肺转移结节以及肺组织病理切片,证明了该纳米药物递送系统治疗时,肺结节数量明显减少,能够有效抑制转移。免疫与化疗的结合,成功激活免疫应答,有效治疗已经形成的转移病灶。该项研究为改善Treg细胞的免疫抑制功能,进而提高化疗敏感性提供了理论基础。CA-1@α-LA-P-mAb纳米系统成功调节了 Treg细胞的免疫抑制功能,从而改善了肿瘤微环境的免疫抑制情况,下调VEGF的生成,有效抑制了乳腺癌的转移。