HSV1-tk基因载体的构建及稳定肺腺癌AGZY细胞系的建立

来源 :哈尔滨医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:li_heping1986
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目的:通过构建含有HSVI-tk(herpes simplex virus type l thymidinekinase,HSVl-tk)基因的载体,以及建立HSVI-tk基因在肺腺癌AGZY细胞系的稳定表达,为进一步开展报告基因显像奠定基础。进而为PET的肿瘤的早期诊断,肿瘤的基因治疗,以及肿瘤治疗过程中的疗效监测提供有效的科学依据。方法:复苏肺腺癌AGZY细胞株,进行体外培养。同时依据GenBank公布的HSVI-tk基因序列设计两对引物,两对引物的上、下游引物分别含有启始密码子、终止密码子及酶切位点。通过PCR方法,以含有HSVl-tk基因的pHSV106质粒为模板,以设计的两条引物进行反应,扩增目的基因片段。经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,与表达载体进行连接,构建载体。经酶切鉴定后用电穿孔法转化肺腺癌AGZY细胞,最后观察转化的肺腺癌AGZY细胞与未转化的肺腺癌细胞在外形、结构上,以及生长曲线上的差异。提取转化的肺腺癌AGZY细胞DNA与RNA,用PCR方法、RT-PCR方法、细胞原位杂交法分别检测HSVI-tk基因在肺腺癌AGBY细胞系的整合与DNA、RNA水平上的表达。结果:(1)将含有HSVI-tk基因的pHSV106质粒为模板,以预先设计的两对引物用PCR法进行反应,扩增基因片段,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,PCR反应产物与HSVI-tk基因的碱基数相同:(2)将HSVI-tk基因片段与载体连接的重组体,经双酶切后进行扩增基因片段,其结果与HSVI-tk基因序列一致;(3)经过G418筛选后,未被转化的细胞全部死亡。观察未死亡的含有HSVI-tk基因的肺腺癌AGZY细胞的外表、形态、以及细胞的生长曲线,均与肺腺癌AGZY细胞无统计学差异;(4)提取含有HSVI-tk基因的肺腺癌AGZY细胞的DNA、RNA,用PCR方法、RT-PCR方法、细胞原位杂交法分别检测,其与HSVI-tk基因序列相同。结论:(1)成功构建了含有HSVI-tk基因的载体,建立了稳定表达HSV l-tk基因的肺腺癌AGZY细胞株;(2)HSVI-tk基因可以作为报告基因用于基因显像,进而应用于肿瘤的早期诊断,肿瘤的基因治疗以及治疗过程中的疗效检测;(3)在一定条件下,HSVI-tk基因可以作为报告基因用于部分肺癌的基因显像。
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