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乳腺癌已成为威胁全球女性身心健康最主要的肿瘤之一,乳腺癌的发病机制的研究及其早期诊断、预防以及治疗乳腺癌是目前迫切需要解决的问题。越来越多的证据表明microRNA表达的失调和乳腺癌的发生发展以及转移密切相关,microRNA可促进或者抑制肿瘤的发生。已有研究表明,miR-154参与包括小细胞肺癌、直肠癌、甲状腺癌等在内的多种肿瘤的发生发展,但是miR-154在乳腺癌中的表达变化以及功能还没有相关报道,本研究运用分子生物学和细胞生物学等技术手段,旨在探讨miR-154在乳腺癌的表达模式及其作用机制,为临床揭示乳腺癌的发病机制以及治疗和预防乳腺癌提供理论依据。研究目的:研究探讨miR-154在乳腺癌发生发展中的作用机制,为临床乳腺癌的预防与治疗提供理论依据。研究方法:本文收集36例临床确诊的乳腺癌患者的癌组织、癌旁组织和一系列乳腺癌细胞系,通过定量RT-PCR技术研究乳腺癌细胞中miR-154的表达水平。体外细胞实验:我们通过CCK8实验法、流式细胞法、细胞损伤实验法和转移侵袭法研究乳腺癌细胞的增殖、克隆、转移和侵袭情况。体内实验:采用裸鼠成瘤实验验证miR-154抑制小鼠体内乳腺癌生长。荧光酶报告和Western blot技术证明miR-154主要通过抑制E2F5的表达从而抑制乳腺癌的发生、发展及转移。研究结果:(1)miR-154的表达在乳腺癌组织和细胞系中下调我们收集了36例乳腺癌患者乳腺癌组织和癌旁正常组织,通过RT-PCR探究miR-154的表达模式,RT-PCR结果提示,与癌旁正常组织相比,36例乳腺癌患者乳腺组织中miR-154的表达明显下调,有统计学差异,P<0.01。我们检测了培养的乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231、BT-549和MDA-MB-453)中miR-154的表达变化,RT-PCR结果提示,与我们培养的人正常乳腺上皮细胞系(MCF-10A)相比,上述三种乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231、BT-549)中miR-154的表达明显下调,有统计学差异,P<0.01,MDA-MB-453乳腺癌细胞中miR-154的表达也下调,P<0.05,有统计学差异。(2)miR-154抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆能力接下来我们研究miR-154在乳腺癌发生发展中的具体机制和功能。首先我们化学合成miR-154的模拟物以及正常microRNA对照,RT-PCR结果提示,与转入正常对照microRNA序列相比,转入miR-154模拟物后,MCF-7细胞中miR-154的表达明显上升,表达模式明显逆转,P<0.01,有统计学差异。我们实验结果提示,与转入对照microRNA序列相比,过表达miR-154后48小时开始抑制细胞的增殖能力,P<0.05,有统计学差异,转染72小时后抑制增殖能力更加明显,P<0.01,有统计学差异。实验结果提示,与转入对照microRNA序列相比,过表达miR-154后可以明显抑制细胞的克隆能力,P<0.01,有统计学差异,抑制癌细胞的克隆能力即提示抑制脱落癌细胞的生存能力。我们通过流式细胞术检测过表达miR-154后对乳腺癌细胞系细胞周期的影响。实验结果提示,与转入对照microRNA序列相比,过表达miR-154后乳腺癌细胞G0/G1期所占时程明显增加,而S期明显缩短,P<0.01,有统计学差异。我们实验结果提示,过表达miR-154可以明显阻滞细胞周期,抑制细胞分裂。(3)miR-154抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力乳腺癌转移依赖乳腺癌细胞的迁移能力和破坏周围细胞基质的侵袭能力。我们通过评价过表达miR-154后乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力评估其对乳腺癌迁移的影响,实验结果提示,与转入对照microRNA序列相比,过表达miR-154后乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显减弱,有统计学差异,P<0.01。(4)体内实验中miR-154抑制裸鼠体内乳腺癌的生长裸鼠成瘤实验中,我们通过RT-PCR检测小鼠体内乳腺癌组织中miR-154表达情况,结果提示,与转入正常对照microRNA序列相比,转入miR-154模拟物后,小鼠乳腺癌细胞中miR-154的表达明显增加,P<0.01,有统计学差异,过表达miR-154可以明显抑制小鼠体内乳腺癌细胞的生长,P<0.05,有统计学差异。(5)E2F5是miR-154的调控靶点我们通过生物数据库Targetscan6.2和miRWalk分析和miR-154结合的靶基因,通过文献比对和分析,我们把E2F5设定为miR-154的靶基因。荧光素酶报告实验进一步证实,与过表达含E2F5 3’端(3’UTR)突变位点的质粒相比,过表达E2F5质粒后荧光吸收光值更高,并有统计学差异,p<0.05,提示miR-154可以和E2F5直接结合;最后我们通过RT-PCR和western blot从转录和蛋白水平证实,miR-154过表达以后,可以明显抑制MCF-7细胞中E2F5的mRNA和蛋白表达,并有统计学差异,P<0.01。(6)乳腺癌组织和细胞中E2F5的mRNA和蛋白水平均明显上调并且和miR-154的表达呈负相关我们分别通过RT-PCR和western blot实验检测了乳腺癌患者乳腺癌组织和癌旁正常组织的E2F5mRNA和蛋白表达情况,实验结果提示,如癌旁组织相比,乳腺癌组织中E2F5的mRNA和蛋白水平明显上升,有统计学差异,P<0.01。我们还进一步证实,乳腺癌组织中E2F5和miR-154的mRNA表达呈明显负相关,相关系数为r=-0.451,P=0.006,有统计学差异;我们还检测了四种乳腺癌细胞系中E2F5的蛋白表达情况,实验结果提示,与正常乳腺上皮细胞相比,四种乳腺癌细胞系中E2F5的蛋白表达明显上调。(7)抑制E2F5可以明显抑制乳腺癌的发生、发展和转移。为了进一步明确E2F5在乳腺癌组织中的作用,是否与miR-154相反,我们化学合成E2F5的小干扰RNAi和对照RNAi的干扰序列,然后转染MCF-7乳腺癌细胞,我们首先验证转染效率和E2F5 RNAi对E2F5的敲除效率。Western blot实验结果提示,与转染对照RNAi序列相比,转染E2F5 RNAi后可以显著敲减乳腺癌细胞中E2F5的蛋白表达。转染对照RNAi序列相比,转染E2F5 RNAi后48小时开始抑制细胞的增殖能力,P<0.05,有统计学差异,转染72小时后抑制增殖能力更加明显,P<0.01,有统计学差异;接下来,我们检测敲除E2F5后对乳腺癌细胞克隆能力的影响,实验结果提示,与转染对照RNAi序列相比,敲除E2F5后可以明显抑制细胞的克隆能力,P<0.01,有统计学差异。与过表达miR-154类似的是,我们还检测了敲减E2F5后对乳腺癌细胞周期的影响,流式细胞术实验结果提示,与转染对照RNAi序列相比,敲减E2F5后乳腺癌细胞G0/G1期所占时程明显增加,而S期明显缩短,P<0.01,有统计学差异。我们实验结果提示,抑制E2F5的表达可以明显阻滞细胞周期,抑制细胞分裂。最后我们检测了敲减E2F5的表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,实验结果提示,与转染对照RNAi序列相比,敲减E2F5后乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力明显减弱,有统计学差异,P<0.01。结论和创新点本研究首次证实miR-154在乳腺癌的发生发展中表达下调,并且miR-154主要通过抑制E2F5的表达从而抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆以及乳腺癌的发生、发展和淋巴转移。而且过表达miR-154或者敲减E2F5的表达可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖和克隆能力并阻滞细胞周期从而抑制肿瘤的发生发展。本研究进一步揭示了乳腺癌的发生过程以及机制,上调miR-154的表达或者敲减E2F5表达可以明显抑制乳腺癌的发展,为临床设计和治疗乳腺癌提供参考。