腹主动脉瘤（AAA）是一种具有高致死率的主动脉疾病,其患者多为老年男性,瘤体破裂后死亡率高达90%。腹主动脉瘤的特征是腹主动脉的节段性全层扩张,具有突然破裂和腔内血栓形成的风险。外科手术是目前防治AAA的唯一有效措施,但其存在一定局限和不足。患有较小腹主动脉瘤的患者一般不予治疗而采取监测的策略,但也存在巨大的风险,因为腹主动脉瘤的进展速度是高度可变的,突然破裂通常是不可预测的和致命的。临床研究表明现有药物在治疗AAA中效果不理想,且不少药物长期使用会导致严重的毒副作用,故亟需发展AAA药物治疗新策略和创新型靶向递送系统。因此本课题设计合成了系列结构新颖的广谱活性氧（ROS）清除性两亲性聚合物,基于三聚氯氰（TCT）为骨架通过键合具ROS清除性和响应性基团苯硼酸频哪醇酯（PBAP）、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧自由基（Tpl）,最后键合聚乙二醇（PEG）合成系列广谱ROS清除性两亲聚合物,通过自组装形成具有ROS响应性和清除性的纳米胶束。该纳米胶束能通过病灶微环境的调控,靶向到AAA血管损伤部位,减轻氧化应激,抑制炎症反应和血管损伤,非常有效抑制腹主动脉瘤直径的扩张和破裂。方法1.生物活性两亲性聚合物的合成和表征本课题设计合成了一系列基于TCT的ROS响应性材料。首先将PBAP偶联在TCT上,然后将上步产物与Tpl反应,最后加入m PEG2000-NH2得到TPT。根据同样的方法,合成了键合两个PBAP的TPP和键合两个Tpl的TTT。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）、核磁共振光谱（~1H NMR）、红外光谱（FT-IR）和电子自旋共振光谱（EPR）对产物进行了表征。2.生物活性两亲性聚合物的体外ROS清除能力评价使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）来测定上述合成材料的自由基清除能力。将TPT与过量的H2O2、超氧阴离子和羟自由基反应,然后分别用过氧化氢试剂盒、超氧阴离子试剂盒和羟基自由基试剂盒检测TPT的清除能力。利用本课题组之前报道过的发光纳米探针（Lu-b CD NP）,考察了TPT的次氯酸盐清除能力。按照同样的方法,比较了TPP、TTT和TPT的广谱活性氧清除效率。3.生物活性两亲性聚合物在过氧化氢中的水解在TPT的甲醇溶液中加入过量的H2O2,共孵育后,将水解产物通过~1H NMR和高分辨质谱（HR-MS）进行检测。将TPT与不同浓度的H2O2孵育后,用高效液相色谱对水解产物进行分析,探究TPT的水解机制。按照类似的方法,探究了TPP和TTT水解机制。4.纳米胶束的表征将纳米胶束水溶液约（5 mg/m L）滴加在铜网格上,然后用磷钨酸负染,通过透射电子显微镜（TEM）来对纳米胶束的形貌进行观察。5.体外细胞摄取实验将RAW264.7小鼠巨噬细胞、血管平滑肌细胞（VSMCs）或小鼠腹腔中性粒细胞与TPTN-Cy5孵育不同时间。巨噬细胞和VSMCs细胞质利用溶酶体探针标记。固定后细胞核用DAPI染色。细胞摄取的情况使用激光共聚焦显微镜观察,同时利用流式细胞仪进行定量研究。通过类似的方法,考察细胞摄取的剂量依赖性。6.抑制VSMCs钙化的效应评价通过茜素红染色法来评价细胞的钙化程度。用不同的纳米胶束与VSMCs共孵育24小时,然后在无机磷（Ca/Pi）中培养一天,用4%多聚甲醛固定,使用光学显微镜评价细胞的钙化情况。7.体外治疗作用评价通过荧光探针DCFH-DA法检测佛波酯（PMA）诱导后巨噬细胞、中性粒细胞和VSMC中的细胞内ROS水平。细胞纳米胶束孵育不同的时间,用200 ng/m L PMA刺激后,每孔加入DCFH-DA,随后利用荧光显微镜观察荧光强度。此外,细胞内ROS水平通过流式细胞术进行量化。8.抑制VSMCs凋亡效应评价采用Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测了TPTN对高浓度羟基自由基导致VSMCs凋亡的保护作用。细胞与纳米胶束共孵育12小时后,细胞用200μM羟基自由基溶液处理6小时。将细胞重新悬浮在含有膜联蛋白V-APC和碘化丙啶（PI）溶液的膜联蛋白V结合缓冲液中,随后通过流式细胞术分析样品。9.TPTN在AAA大鼠的血管靶向性研究AAA模型建立2周后,尾静脉注射TPTN-Cy5,不同处理后,取血管、血液和主要脏器,用IVIS光谱系统观察荧光强度和分布情况。另外通过血管冰冻切片,分别对内皮细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞进行标记,观察纳米粒分布。10.不同纳米胶束在体内防治腹主动脉瘤的效应评价建立氯化钙（CaCl2）诱导的大鼠腹主动脉瘤模型后,通过尾静脉注射5 mg/kg不同纳米胶束治疗。23天后,大鼠安乐死。将腹主动脉中段制成石蜡切片,分别用茜素红、H＆E和EVG染色。过氧化氢和钙的含量分别用过氧化氢试剂盒和钙试剂盒定量,并通过ELISA试剂盒测定TNF-α和MPO的水平。11.TPTN在体内防治腹主动脉瘤的作用为了进一步研究TPTN对AAA大鼠的防治效果,用不同剂量的TPTN治疗AAA大鼠,用Vevo 3100微超声成像系统测量血管最大直径,腹主动脉中段行组织切片和免疫组化染色,过氧化氢和钙的含量分别用过氧化氢试剂盒和钙试剂盒定量。并通过ELISA试剂盒检测炎症因子水平,并通过DHE冰冻切片评估ROS的水平。12.体内和体外初步安全性评价TPTN与巨噬细胞、VSMCs孵育后,使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）对细胞毒性进行量化评估。为了研究纳米胶束急性毒性和长期毒性,不同给药方案处理后,记录大鼠体重变化,通过血样分析血常规和肝肾功,收集主要脏器并称重,并进行H＆E染色切片,观察脏器的变化。结果1.通过将PBAP和Tpl键合到TCT上,合成了ROS响应性和清除性材料TPT,同时将两个PBAP键合到TCT合成了TPP,将两个Tpl键合到TCT合成了TTT,通过~1H NMR光谱和MALDI-TOF质谱证实了材料的成功合成。2.通过不同材料对活性氧的清除能力进行测定,发现TPP能有效清除了H2O2和次氯酸根,而TTT对于羟基自由基、超氧阴离子和DPPH·有良好的清除性,TPT则剂量依赖性的对于上述不同种类的ROS均具有良好的清除作用。同时证明在过氧化氢的条件下,TPP、TTT和TPT均能彻底水解成可完全溶于水的小分子。4.体外细胞实验证明TPTN可以被巨噬细胞、中性粒细胞和VSMCs有效摄取,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪可以观察到细胞的吞噬行为呈现时间和剂量的依赖性。5.体外实验也证实TPTN能有效减少VSMCs的钙沉积,抑制PMA诱导的巨噬细胞、中性粒细胞和VSMCs胞内ROS的产生。同时TPTN能有效清除胞内活性氧,抑制羟基自由基介导的VSMCs的凋亡,总体效果优于TPPN、TTTN。6.在大鼠腹主动脉瘤模型中,尾静脉注射5 mg/kg的三种纳米胶束,均可以有效降低血管直径,抑制动脉瘤的进展,降低血管的钙化情况和相关炎症因子的表达。同时,也可以发现TPTN的疗效更优于其余两组。7.TPTN能有效地靶向到AAA大鼠模型的血管损伤部位。Cy5标记的TPTN经过尾静脉注射后,用IVIS光谱系统观察到血管损伤部位具有大量的荧光信号,证实了TPTN具有靶向作用。同时在冰冻切片中可以观察到纳米粒与中性粒细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞具有很强的共定位。8.进一步研究了TPTN在大鼠腹主动脉瘤模型的疗效,证实随着TPTN剂量的增加,治疗效果也更好,有效减轻血管钙化和抑制了腹主动脉瘤的发展进程,降低了促炎症因子和基质金属蛋酶的表达,减轻了血管局部的ROS水平。9.体内外的初步安全性评价实验表明TPTN基本无细胞毒性,另外溶血实验证实即使较高浓度TPTN与红细胞孵育,也几乎无溶血现象。同时尾静脉注射TPTN,在急性毒性或者长期毒性实验中,大鼠体重、脏器指数、血常规、肝肾功与对照组均无显著差异,主要脏器切片也未观察到明显的病理改变。结论1.设计及合成了系列生物活性和两亲性聚合物,可以自组装形成具有抗炎和抗氧化应激功能的纳米胶束,其中TPTN具有广谱ROS清除性。2.细胞水平,TPTN能被细胞迅速吞噬,有效抑制VSMCs钙化,抑制羟基自由基诱导的VSMCs凋亡,同时能清除PMA诱导中性粒细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞胞内产生的过量ROS。3.在AAA模型中,TPTN表现出更优的治疗效果,能通过有效清除过量的ROS,减少氧化应激,从而减轻血管钙化,减轻病变部位的炎症和抑制腹主动脉瘤的发展进程。4.通过体内外初步的安全性评价表明,TPTN具有良好的生物安全性。综上所述,TPTN可以被动靶向至腹主动脉瘤的血管损伤部位,从而高效治疗腹主动脉瘤。另外,本研究设计合成的TPTN是一种有效、价格低廉、安全的纳米药物,同时其在炎症和氧化应激的相关疾病具有十分优秀的治疗作用,值得进一步探索,如增加主动靶向单元提高其靶向性,或者负载药物提高其疗效。