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研究背景全世界每年约有五千万人遭受创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）,其高死亡率及严重的后遗效应受到广泛关注。TBI后遗效应中运动、认知等神经功能的损害主要与伤后慢性神经炎症的持续进展有关。小胶质细胞作为中枢神经系统（central nervous system,CNS）中参与固有免疫的重要细胞,在神经炎症的发展中起着重要作用。NLRP3（nucleotide-binding domain,leucine-rich-repeat containing family,pyrin domain containing-3）炎症小体是一个大蛋白复合物,在CNS中主要表达于小胶质细胞中,由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein,ASC）和半胱天冬酶-1（caspase 1）组成。已有研究表明,NLRP3炎症小体的活化能够引起细胞焦亡和炎症级联反应,是慢性创伤性脑病和许多神经退行性疾病慢性炎症损伤的重要原因。腺苷2A受体(adenosine 2A receptor,A2AR)在中枢神经系统中广泛表达,已有研究证实A2AR在帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）、阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）等CNS疾病中发挥着重要的神经炎症调控作用,其在TBI中也与神经炎症的调控高度相关。A2AR受体的活化主要表现为抗炎效应,但在CNS中由于伤后谷氨酸浓度的急剧升高,其抗炎效应转变为促炎效应。这种效应转变的主要原因是高浓度谷氨酸环境下,A2AR与代谢型谷氨酸受体5相互作用,其下游信号通路由抗炎的PKA通路重定向至促炎的PKC通路。此外,已有报道表明A2AR在血管内皮细胞及巨噬细胞中参与了NLRP3炎症小体的调控。但由于A2AR在不同类型细胞和部位具有不同甚至相反的效应,小胶质细胞中A2AR对NLRP3炎症小体的调控在TBI后神经炎症进展中的作用及机制仍有待阐明。研究内容与方法在动物实验中,我们构建了小胶质细胞NLRP3或A2AR特异性敲除的小鼠,通过行为学检测（神经功能评分、平衡木试验、加速转棒试验和旷场试验）、免疫荧光、western blot（WB）等方法,探究小胶质细胞中NLRP3活化对中度TBI后7d神经炎症的影响及伤后A2AR对NLRP3炎症小体活化的调控效应。在原代小胶质细胞中,通过CCK-8、WB、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、定量PCR（quantitative PCR,qPCR）、免疫荧光和蛋白质免疫共沉淀（Coimmunoprecipitation,Co-IP）等手段,探究小胶中A2AR对NLRP3炎症小体组装与活化的影响及调控机制,以及这种调控效应在不同浓度谷氨酸环境下的变化。实验结果及结论1.TBI后小胶质细胞中A2AR对NLRP3炎症小体的调控效应研究1)TBI后伤周皮层中小胶质细胞A2AR和NLRP3表达显著升高且在小胶质细胞中存在大量共定位。分选TBI伤后7d伤周皮层小胶质细胞,WB检测A2AR和NLRP3含量,结果表明TBI后小胶中A2AR和NLRP3显著升高。免疫荧光也证实了两者的表达升高,并在小胶质细胞（Iba-1+）中存在大量共定位。2)小胶质细胞NLRP3特异性敲除(NLRP3CX3CR1)能显著抑制TBI后神经功能缺损、炎性因子释放和神经病理改变。NLRP3CX3CR1有效减轻了TBI后24h脑水肿程度及伤后3d、7d的运动功能损害。WB检测炎性因子（IL-1β和IL-18）和突触相关蛋白（PSD95、SNAP25、VAMP1、SYN1）水平,结果表明NLRP3CX3CR1具有抑制神经炎症,减轻伤后突触损伤的作用。HE染色证实伤后7d炎性细胞浸润得到抑制。免疫荧光检测证实NLRP3CX3CR1能够有效抑制TBI后小胶质细胞活化（CD68+）和树突（MAP2+）损伤,对星形胶质细胞（GFAP+）和神经元（NeuN+）数量无显著影响。3)小胶质细胞A2AR特异性敲除(A2ARCX3CR1)能抑制TBI后伤周皮层NLRP3炎症小体的活化,进而改善伤后神经功能缺损、炎性因子释放和神经病理改变。实验结果显示A2ARCX3CR1能够抑制TBI 7d后NLRP3炎症小体的表达与活化,进行改善TBI后脑水肿和运动功能损害。此外,A2ARCX3CR1也能减少突触蛋白丢失（PSD95、SNAP25、VAMP1、SYN1）,及抑制炎症因子释放（IL-1β和IL-18）、小胶活化（CD68+）和树突损伤（MAP2+）。2.小胶质细胞中A2AR通过与NLRP3蛋白相互作用调控NLRP3炎症小体的组装与活化1)A2AR激动剂能抑制原代小胶质细胞中NLRP3炎症小体活化所致的细胞焦亡和炎性因子释放。使用A2AR激动剂CGS21680（CGS）预处理LPS+ATP刺激的原代小胶质细胞,能够减少细胞死亡和LDH释放,抑制NLRP3炎症小体下游炎性因子释放（IL-1β和IL-18）,并减弱caspase 1活性。2)小胶质细胞中A2AR激动剂能抑制pro-caspase 1和全长Gasdermin D（full length Gasdermin D,FL-GSDMD）的剪切而不影响NLRP3炎症小体相关组分的表达。WB检测NLRP3炎症小体相关蛋白（NLRP3、ASC、pro-caspase 1、caspase 1 p20、FL-GSDMD和GSDMD蛋白N端（N-terminal of GSDMD,N-GSDMD））的表达,结果证实CGS仅抑制了caspase 1 p20和N-GSDMD的水平,而不影响其他组分的蛋白水平。qPCR进一步检测证实了CGS处理不影响NLRP3炎症小体相关蛋白（NLRP3、ASC、caspase 1、GSDMD、IL-1β和IL-18）mRNA含量。3)小胶质细胞中A2AR通过与NLRP3蛋白相互作用促进NLRP3炎症小体组装。通过Co-IP检测A2AR与NLRP3蛋白相互作用,结果表明LPS+ATP刺激下A2AR与NLRP3相互作用增强,GCS处理能够抑制其相互作用。ASC荧光斑点检测证实CGS处理抑制了NLRP3炎症小体的组装。此外,使用A2AR抑制剂ZM241385（ZM）也能降低细胞上清中IL-1β、IL-18和caspase 1含量,表明ZM也具有抑制NLRP3炎症小体活化的作用。通过A2AR敲除(A2AR-KO)消除其与NLRP3蛋白相互作用,上清IL-1β、IL-18和caspase 1含量也显著降低。NLRP3敲除（NLRP3-KO）后,炎性效应被阻断,CGS干预对上清IL-1β、IL-18和caspase 1含量无影响。3.高浓度谷氨酸环境逆转A2AR激动剂对NLRP3炎症小体组装与活化的抑制效应1)高浓度谷氨酸环境逆转了小胶质细胞中A2AR激动剂对NLRP3炎症小体活化的抑制作用。在高浓度谷氨酸条件下,CGS的效应由抑炎转变为促炎,表现为促进细胞死亡、LDH释放、IL-1β和IL-18释放,增强了caspase 1活性。2)高浓度谷氨酸逆转了A2AR激动剂对pro-caspase 1及FL-GSDMD剪切的抑制作用而不影响NLRP3炎症小体各组分的表达。WB检测NLRP3炎症小体各组分蛋白的含量,结果表明高浓度谷氨酸下CGS能够促进pro-caspase 1和FL-GSDMD的剪切,而不影响其他组分蛋白的含量。qPCR实验也证实NLRP3炎症小体相关蛋白mRNA含量没有显著变化。3)高浓度谷氨酸环境逆转了CGS对NLRP3炎症小体组装的抑制效应。免疫共沉淀结果表明低浓度谷氨酸下A2AR活化后NLRP3与caspase 1的相互作用受到抑制,而在高浓度谷氨酸下其相互作用增强。免疫荧光检测ASC荧光斑点也具有相似结果。此外,高浓度谷氨酸条件下,ZM能够逆转CGS的促炎效应。总结综上所述,本研究表明TBI后小胶质细胞中A2AR对NLRP3炎症小体具有重要调控作用且显著影响了伤后神经炎症进展。我们证实了小胶质细胞中A2AR通过与NLRP3相互作用从而调控NLRP3炎症小体的组装与活化,并且这种调控作用受谷氨酸浓度的影响。本研究进一步阐明了小胶质细胞中A2AR在神经炎症中扮演的重要角色及其对NLRP3炎症小体的调控机制,为神经炎症和NLRP3炎症小体相关疾病提供了重要的治疗靶点。