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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,肺脏是远处转移的优先器官,转移相关的并发症是其主要死因,因此乳腺癌肺转移的早期诊断对提高乳腺癌患者的生存率及其生存质量至关重要。在本课题研究中,我们基于聚集诱导发光材料、中性粒细胞靶向单元PGP以及课题组前期合成的材料LCD,构建了具有中性粒细胞靶向性能的自发光纳米探针（LAD-PGP NP）,并将其运用于小鼠乳腺癌早期肺转移的成像,为探讨乳腺癌肺转移早期诊断的影像学方法奠定一定的基础。方法1.中性粒细胞响应性发光材料LCD的合成与表征在课题组前期研究基础上合成中性粒细胞响应性发光探针LCD,然后利用核磁氢谱、红外光谱等对LCD进行表征。2.聚集诱导发光材料PPV的合成和表征按照文献方法合成具有聚集诱导发光性质的近红外荧光材料PPV,通过核磁氢谱、LC-MS对其表征。PPV分别溶解在不同水含量的水/THF混合溶剂中,使用荧光分光光度计获取不同样品的荧光光谱。3.中性粒细胞响应性发光纳米粒LAD NP的制备及表征利用LCD材料和PPV的亲疏水性质,通过纳米沉淀自组装法成功构建了球形结构、大小均一的LAD NP纳米粒。透射电镜、马尔文粒径仪等方法对其形态学和粒径大小表征。4.LAD NP的体外发光性能研究通过光纤光谱仪及IVIS活体成像仪分别研究了LAD NP的体外CRET效应、体外发光性能以及体外成像能力,并探讨了LAD NP发光的组织穿透能力。5.LAD NP在中性粒细胞中内化能力的评价6-8周雌性BALB/c小鼠腹腔注射巯基乙酸盐溶液以刺激产生中性粒细胞,4 h后提取腹腔灌洗液,离心后收集腹腔中性粒细胞。随后将LAD NP加入铺有中性粒细胞的孔板中,通过CLSM和流式细胞术观察其内化行为;同时添加不同抑制剂后通过流式细胞术探讨其内化的主要途径。6.LAD NP对中性粒细胞的体外成像取12孔板,PMA刺激中性粒细胞后,分离其培养基,在培养基和铺有细胞的孔板中分别加入LAD NP,用IVIS活体成像仪进行成像观察。取不同数量的中性粒细胞铺至12孔板中,随后加入LAD NP进行IVIS成像。7.LAD NP在乳腺癌肺转移模型中的成像BALB/c雌性小鼠尾静脉注射4T1-GFP细胞构建乳腺癌肺转移小鼠模型,取不同时间点的小鼠肺组织进行免疫荧光切片,探讨乳腺癌肺转移小鼠模型肺组织中中性粒细胞与肿瘤细胞的相关性。为了探讨LAD NP的体内成像能力,分别于不同时间点对乳腺癌肺转移小鼠尾静脉注射LAD NP,将小鼠置于IVIS成像仪中成像,观察其肺组织发光强度的变化。8.LAD NP的生物相容性评价不同浓度的LAD NP与4T1细胞、腹腔中性粒细胞分别共孵育后,CCK-8检测细胞活性。小鼠尾静脉注射高剂量LAD NP后15天处死小鼠,分别计算各脏器的脏器指数、血常规和肝肾功水平,并通过H＆E染色观察各器官病理变化。9.中性粒细胞靶向纳米粒LAD-PGP NP的制备及表征通过纳米沉淀法构建PGP修饰的LAD NP,通过离心和重复洗涤去除有机溶剂以收集最终产物LAD-PGP NP。10.LAD-PGP NP的体外中性粒细胞靶向性能研究提取小鼠腹腔中性粒细胞于12孔板孵育,随后分别加入不同纳米探针,孵育1 h后分别通过流式细胞术和激光共聚焦观察其吞噬情况。11.LAD-PGP NP在乳腺癌肺转移模型中的成像在构建乳腺癌肺转移模型3周后,分别尾静脉注射LAD-PGP NP、LAD-PEG NP、LAD NP纳米探针,立即于IVIS成像系统中进行体内发光成像,完毕后取出小鼠肺组织,4℃放置,待24小时自发光淬灭后进行体外荧光成像;另外一组模型鼠尾静脉注射LAD-PGP NP后12 h处死小鼠,取小鼠肺组织进行免疫荧光染色及流式定量分析,观察纳米探针与中性粒细胞的共定位。分别于不同时间点经模型鼠尾静脉注射LAD-PGP NP后立即将小鼠置于IVIS成像系统中成像。同时对小鼠肺泡灌洗液中的中性粒细胞数量、H2O2水平以及MPO水平进行测定,并与发光强度进行相关性分析。12.乳腺癌肺转移模型鼠中micro PET/CT的成像在建模后的不同时间点采集图像,小鼠检测前一天单独放置,以降低机体的代谢水平。通过尾静脉注射18F-FDG后立即将小鼠置于micro PET/CT中进行成像,以分别收集PET图像和CT图像。结果1.核磁氢谱、红外光谱等证实LCD成功合成,透射电镜观察显示经纳米沉淀自组装法成功构建的中性粒细胞响应性发光纳米粒LAD NP,为球形结构、粒径大小约为230 nm、表面呈负电性。2.LAD NP具有较好的体外响应性发光性能,对MPO、H2O2及Cl O-具有良好的响应性,发光时间可持续至少1 h,波长约为620 nm,组织穿透性强。3.小鼠腹腔灌洗液中的中性粒细胞在体外可吞噬LAD NP,该吞噬作用主要通过胞吞作用,且具有时间依赖性。LAD NP被活化的中性粒细胞吞噬后具有较强的发光能力且发光持续时间较长。4.尾静脉注射10~5 4T1-GFP细胞成功建立了乳腺癌肺转移模型,通过H＆E切片和免疫荧光观察到小鼠肺组织内中性粒细胞数量和肿瘤细胞数量呈线性相关,且均具有良好的时间相关性;同时发现小鼠乳腺癌肺转移模型中中性粒细胞含量、MPO和H2O2水平、肿瘤细胞数量与LAD NP的体内发光强度具有良好的相关性。5.通过将中性粒细胞靶向肽PGP和DSPE-PEG连接,成功构建中性粒细胞靶向单元,随后通过纳米沉淀自组装法构建中性粒细胞靶向发光纳米粒（LAD-PGP NP）,该纳米粒为大小形态均一的球形结构,ζ电位呈负性。6.中性粒细胞体外CLSM表明LAD-PGP NP较LAD NP具有更好的中性粒细胞靶向能力,离体肺组织成像及免疫荧光切片观察到该靶向纳米探针与肺组织中性粒细胞具有较好的共定位。7.乳腺癌肺转移模型鼠尾静脉注射LAD-PGP NP后,IVIS成像显示LAD-PGP NP组的小鼠肺部发光强度及离体肺组织荧光强度均强于LAD NP组、LAD-PEG NP组,提示LAD-PGP NP在小鼠肺转移模型中良好的中性粒细胞靶向性及成像能力。其成像时间点早于PET/CT成像手段。8.体外安全性实验证实LAD NP对细胞活性无影响,尾静脉注射高剂量500mg/kg和1000 mg/kg LAD NP均对小鼠体重、脏器指数、肝肾功和血常规无明显影响。结论1.基于课题组前期研究合成的中性粒细胞响应性发光材料LCD,同时负载聚集诱导发光材料PPV,通过纳米沉淀自组装成功构建了均一的具有球形结构的发光纳米探针LAD NP;随后在表面修饰中性粒细胞CXCR2靶向单元PGP肽,成功构建了具有较好中性粒细胞靶向效果的纳米探针LAD-PGP NP。2.LAD NP体外发光能力良好,发光时间长,强度高,且具有良好的组织穿透性,同时具有较好的MPO和H2O2依赖性发光。同时,LAD NP在体外可被中性粒细胞吞噬,该吞噬作用具有较好的时间依赖性。LAD NP进入中性粒细胞内部后发光,发光持续时间较长,可较好地对中性粒细胞成像。3.LAD-PGP NP作为具有中性粒细胞靶向效果的新型纳米成像探针,通过对乳腺癌肺转移进程中肺组织大量中性粒细胞浸润的成像,可以对乳腺癌肺转移的发生进行精准监测,实时监测肿瘤转移的发生发展。4.LAD NP具有良好的生物相容性,在动物体内无明显的毒副作用。综上所述,本课题基于课题组前期研究自发光材料LCD和聚集诱导发光材料PPV构建的中性粒细胞生物响应性发光纳米探针LAD-PGP NP,可作为一种及时、精准、安全的成像手段,通过动态监测乳腺癌肺转移模型中肺组织内中性粒细胞实现对于肺转移的监测。