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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的自身免疫性、高发病率和致残性疾病,在关节软骨和骨骼的间质中具有大量炎性细胞。中性粒细胞在RA的发生发展中起重要作用,中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophi L extracellular traps,NETs）由活化的中性粒细胞释放,NETs可以产生循环的瓜氨酸化蛋白并诱导自身免疫反应,引起滑膜炎症。RA外周血和关节腔滑液中有大量的免疫球蛋白和免疫复合物,它们可以促使中性粒细胞募集和NETs释放,但是免疫球蛋白促进RA外周血和滑膜液中NETs的水平升高有何作用至今鲜有报道。课题组前期发现血清中高水平表达IgD与RA临床诊断指标之间有相关性,IgD异常高表达可通过活化T细胞促进B细胞的活化,参与RA的发生发展。IgD可以与特定的Fc受体（FcδR或IgDR）结合,该受体最初是在人外周血的T细胞上发现的。我们课题组进一步发现,在RA患者中FcδR的表达也高于健康对照者。RA炎症反应开始时,滑液中的中性粒细胞占浸润细胞的90%。中性粒细胞表面是否表达FcδR,RA患者中高水平表达的IgD是否与NETs形成相关,并从而加重RA的滑膜炎症?本课题拟在前期工作的基础上进一步探索:RA中NETs形成与IgD、anti-CCP及FcδR百分比水平的相关性;IgD是否特异性通过中性粒细胞上FcδR促进NETs的形成?课题组合成的IgD-Fc-Ig融合蛋白是以IgD-FcδR为靶点的,是有治疗RA潜力的自主创新生物制剂（专利许可号:ZL201510600762X,ZL201810692531X）,课题组前期关节炎动物实验结果表明融合蛋白具有治疗效果。IgD-Fc-Ig能否通过阻断IgD结合中性粒细胞上FcδR,减少NETs形成,发挥改善RA滑膜炎症的作用?为此,本研究收集RA和健康人外周血,分离出血浆和中性粒细胞,观察FcδR的表达及NETs、IgD、anti-CCP、FcδR之间的相关性;IgD刺激健康对照者外周血分出来的中性粒细胞,探讨IgD对中性粒细胞产生NETs的影响;采用激光共聚焦、电镜扫描、q PCR进一步研究IgD-Fc-Ig融合蛋白对IgD诱导的NETs形成的影响。建立完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）诱导的AA大鼠关节炎模型,皮下给药IgD-Fc-Ig,观察AA大鼠外周血中性粒细胞功能及成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）功能的变化,进一步明确IgD-Fc-Ig融合蛋白发挥改善AA大鼠滑膜炎症的作用。本课题拟阐明IgD与中性粒细胞表面FcδR在RA中促进NETs的释放作用,为发现RA新的病理机制及将IgD-Fc-Ig作为治疗高IgD型RA的创新药物提供实验依据。目的:明确RA患者血浆中Cit H3与IgD、anti-CCP和FcδR之间的相关性;明确IgD通过与中性粒细胞FcδR结合,促进中性粒细胞释放NETs,诱导形成的NETs促进FLS的异常增殖;揭示IgD-Fc-Ig通过阻断IgD与FcδR结合,减少NETs形成,发挥改善RA滑膜炎症作用的分子机制。方法:收集RA患者和健康人外周血,离心收集血浆,分离出中性粒细胞,流式细胞术检测中性粒细胞上FcδR的表达;ELISA检测RA患者血浆Cit H3、IgD、anti-CCP的水平;流式细胞术检测IgD诱导健康对照者外周血中性粒细胞上表面活化因子（CD16/CD15/FcδR）以及NETs（MPO/Cit H3）的表达;Western blot法检测IgD诱导健康对照者外周血中性粒细胞的MPO、NE、Cit H3蛋白的表达;流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导健康对照者外周血中性粒细胞上表面活化因子（CD16/CD15/FcδR）以及NETs（MPO/Cit H3）的影响;成像流式检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导健康人外周血中性粒细胞NETs（MPO/Cit H3）的影响;q PCR检测IgD诱导中性粒细胞MPO、NE、PAD4的m RNA的表达;CCK-8法检测NETs与RA FLS培养后FLS的增殖;流式细胞术检测RA FLS上MHCⅡ的表达的百分比。研究整体给药IgD-Fc-Ig对AA大鼠整体指标和脾脏及踝关节病理学改变的影响;ELISA检测AA大鼠血浆IgD、anti-CCP2、Cit H3的水平;探讨IgD-Fc-Ig对AA大鼠中性粒细胞功能的影响和症状缓解的机制;流式细胞术检测IgD-Fc-Ig对AA大鼠中性粒细胞ROS表达和中性粒细胞凋亡的影响;q PCR检测大鼠脾脏中性粒MPO、NE、PAD4的m RNA的表达;CCK-8法检测各组大鼠外周血中性粒细胞与AA大鼠FLS的共培养后FLS的增殖。结果:1.RA患者临床指标资料收集44例RA患者,其中男女比例为12:32,年龄（age,years）、类风湿因子（RF,IU/m L）、C反应蛋白（C-reactive protein,CRP,mg/L）、红细胞沉降率（Erythrocyte sedimentation rate,ESR,mm/h）及（anti-CCP,RU/m L）的均数±标准误值分别为57.45±1.62、68.85±10.18、21.22±3.36、34.44±4.83、858.33±101.99。2.RA患者和健康志愿者的血浆中IgD、Cit H3和中性粒细胞上FcδR之间的相关性与健康对照者IgD（43.860±7.708μg/m L）和Cit H3（2.268±0.211ng/m L）相比,RA病人血浆IgD（87.475±34.385μg/m L）、Cit H3（5.8289±1.692ng/m L）水平明显升高;与健康对照者相比,RA患者的中性粒细胞上FcδR百分比显著升高;RA患者的血浆Cit H3浓度与IgD浓度（r=0.4889,P=0.0008）、FcδR水平（r=0.5546,P=0.0007）和anti-CCP水平（r=0.7505,P＜0.0001）具有显著相关性。3.IgD对健康对照者外周血中性粒细胞FcδR和NETs的影响检测中性粒细胞表面FcδR百分比（CD16+CD15+FcδR+）及形成的NETs（MPO+Cit H3+）的百分比。IgD（3、10μg/m L）体外刺激6h后,可明显促进中性粒细胞表面FcδR表达及NETs的产生。4.IgD对健康对照者中性粒细胞MPO、NE、Cit H3蛋白表达的影响与对照组相比,IgD（3μg/m L）刺激的中性粒细胞中MPO和NE及Cit H3蛋白表达增加。5.IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者的中性粒细胞FcδR和NETs的影响健康对照者外周血中分离出的中性粒细胞设为IgD（3μg/m L）、IgD（3μg/m L）+IgD-Fc-Ig（1、3、10μg/m L）组,体外刺激6h后,实验利用流式细胞术和成像流式法检测IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者中性粒细胞上FcδR和NETs表达的百分比。与对照组相比,IgD-Fc-Ig（10μg/m L）可显著降低IgD（3μg/m L）上调健康对照者的中性粒细胞上FcδR和NETs的百分比。6.IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者的中性粒细胞MPO、NE、PAD4 m RNA表达的影响健康对照者外周血中分离出的中性粒细胞经IgD（3μg/m L）或IgD（3μg/m L）+IgD-Fc-Ig（1、3、10μg/m L）处理6h后,抽提中性粒细胞的RNA,与对照组相比,IgD-Fc-Ig（3、10μg/m L）下调IgD引起的NE m RNA,IgD-Fc-Ig（10μg/m L）下调IgD引起的MPO、PAD4 m RNA表达升高。7.IgD-Fc-Ig对IgD诱导的健康对照者中性粒细胞MPO、NE、Cit H3荧光和形态改变的影响与对照组相比,激光共聚焦显微镜和电镜观察可见IgD（3μg/m L）组中性粒细胞释放NETs形成,对照组未发现明显NETs形成,IgD-Fc-Ig（10μg/m L）可明显减少NETs的产生。8.IgD诱导NETs对FLS功能的影响及IgD-Fc-Ig的作用8.1 NETs对FLS细胞增殖的影响与对照组相比,IgD（3μg/m L）和PMA（20nmo L）产生的NETs可诱导FLS增殖,IgD（3μg/m L）合并IgD-Fc-Ig（3、10μg/m L）组产生NETs可下调IgD诱导FLS的增殖。8.2 NETs对FLS细胞上MHCⅡ的影响与对照组相比,IgD（3μg/m L）和PMA（20nmo L）产生的NETs作用48h后可显著增加FLS上MHCⅡ（HLA-DR+）的表达,IgD（3μg/m L）合并IgD-Fc-Ig（10μg/m L）组产生NETs对MHCⅡ的表达产生下调作用。9.IgD-Fc-Ig对AA大鼠整体指标的影响与AA组大鼠相比,IgD-Fc-Ig组大和依那西普组大鼠的体重增加比较明显、全身评分显著改善、足爪容积、关节炎指数和足爪肿胀数都降低,大鼠关节炎症状明显好转。10.IgD-Fc-Ig对大鼠踝关节骨质的破坏的影响与正常组大鼠相比,AA大鼠后爪的X线照射分析显示组织肿胀和骨侵蚀。用IgD-Fc-Ig（9mg/kg）和依那西普（3mg/kg）治疗后,大鼠的X线照射评分有所降低,大鼠组织肿胀和骨侵蚀有所改善。11.IgD-Fc-Ig对AA大鼠血清IgD、anti-CCP2、Cit H3水平的变化的影响与正常对照组相比,AA大鼠血清IgD、Cit H3、anti-CCP2水平明显升高;与AA组大鼠相比,IgD-Fc-Ig（9mg/kg）和依那西普（3mg/kg）明显降低AA大鼠血清IgD、Cit H3、anti-CCP2的浓度。12.IgD-Fc-Ig对AA大鼠脾脏、关节病理的影响与正大鼠脾脏病理相比,AA大鼠的脾脏病理结果显示,脾脏病理动脉周围淋巴鞘增多,边缘区和红髓数量也有所增加,生发中心较大且形状不规则。IgD-Fc-Ig（9 mg/kg）和依那西普治疗后,IgD-Fc-Ig和依那西普明显改善AA大鼠脾脏病理变化。AA组大鼠踝关节与正常对照组相比出现典型的炎症表现,AA大鼠关节面紊乱,滑膜细胞异常增生,炎性细胞浸润严重,血管翳大量出现,软骨破坏,IgD-Fc-Ig和依那西普治疗组得到明显改善。番红O固绿染色也表明IgD-Fc-Ig和依那西普有效改善AA大鼠踝关节软骨损伤.13.IgD-Fc-Ig对AA大鼠外周血中性粒细胞产生ROS和凋亡的影响与正常组大鼠相比,AA大鼠外周血中性粒细胞ROS明显增高,而IgD-Fc-Ig（3、9mg/kg）组和依那西普（3mg/kg）组能明显下调升高的AA大鼠外周血中性粒细胞ROS荧光含量的表达;与正常对照组相比,AA大鼠可以延长中性粒细胞寿命,减少细胞的凋亡;IgD-Fc-Ig（9mg/kg）和依那西普（3mg/kg）可以明显促进细胞凋亡。14.IgD-Fc-Ig对AA大鼠脾脏MPO、NE、PAD4 m RNA表达的影响抽提各组大鼠脾脏RNA,与正常组相比,IgD-Fc-Ig（9mg/kg）和依那西普（3mg/kg）可以显著下调AA大鼠MPO、NE、PAD4 m RNA的表达。15.中性粒细胞对AA大鼠FLS增殖的影响CCK-8法检测FLS的增殖,与正常组大鼠相比,AA大鼠组明显促进FLS增殖,IgD-Fc-Ig（9 mg/kg）组和依那西普（3mg/kg）组可显著降低FLS的活力,下调AA大鼠FLS的增殖。结论:1.RA病人血浆中Cit H3水平与IgD、anti-CCP水平及中性粒细胞上FcδR百分比呈正相关,提示IgD-FcδR可能参与中性粒细胞活化与NETs形成。2.IgD可诱导中性粒细胞的活化,上调FcδR的表达,引起NETs过度形成。IgD-Fc-Ig能够中和异常表达的IgD-FcδR引起的中性粒细胞活化作用,抑制IgD诱导NETs过度形成。3.IgD-Fc-Ig对AA大鼠具有治疗作用,可缓解AA大鼠关节炎症状,降低AA大鼠血浆IgD、Cit H3、anti-CCP2水平,AA大鼠中性粒细胞ROS的产生,并促进中性粒细胞的凋亡,下调AA大鼠脾脏中性粒细胞NETs的形成及PAD4的m RNA的表达。4.RA中IgD与中性粒细胞NETs形成具有相关性,IgD-Fc-Ig有潜力成为通过阻断IgD-FcδR减少NETs的形成而缓解RA症状的具有自主知识产权的新型生物制剂。