论文部分内容阅读
目的:通过建立SD大鼠心肌缺血再灌注损伤模型及原代心肌细胞缺/复氧损伤模型,研究比索洛尔后处理对心肌细胞线粒体自噬及线粒体分裂的作用,并通过应用自噬抑制剂氯喹及慢病毒低表达Drp1的方法,观察比索洛尔对线粒体自噬通路Drp1/Pink1/Parkin的影响,探讨比索洛尔对缺血再灌注/缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用机制。方法:1.实验一:探讨比索洛尔后处理对SD大鼠心肌缺血再灌注诱导的心肌细胞线粒体自噬的影响。对SD大鼠心脏前降支进行结扎,缺血1小时,再灌注72小时,建立SD大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,将SD大鼠随机分组:假手术组（Sham组,n=10）、模型组（即缺血再灌注组,I/R组,n=10）、氯喹+缺血再灌注组（CQ+I/R组,n=10）、缺血再灌注+比索洛尔后处理组（I/R+BS组,n=10）及氯喹+缺血再灌注+比索洛尔后处理组（CQ+I/R+BS组,n=10）;分别采用心脏超声检测心脏功能,HE染色观察心肌坏死程度,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡、Evans blue-TTC双染检测梗死程度（梗死面积/缺血面积,AI/AAR）,Western免疫印迹法检测心肌细胞 LC3、Beclin1、OPAI、Drp1、p-Drp1、Pink1 及 Parkin 蛋白表达情况。2.实验二:通过比索洛尔后处理对原代心肌细胞缺/复氧诱导的线粒体自噬的影响。对SD大鼠新出生1-3d乳鼠心肌细胞进行分离培养36h后进行缺/复氧（6h/6h）,将原代心肌细胞随机分组:正常对照组（CTL组）、比索洛尔后处理组（BS组）、氯喹组（CQ）、缺氧/复氧组（H/R组）、缺氧/复氧+比索洛尔后处理组（H/R+BS组）、氯喹+缺氧/复氧组（CQ+H/R组）、氯喹+缺氧/复氧+比索洛尔后处理（CQ+H/R+BS组）,实验次数n=3;分别采用肌钙蛋白T（cTnT）鉴定原代心肌细胞纯度,用流式法检测原代心肌细胞的凋亡指数,透射电镜检测线粒体形态及线粒体自噬体形成,Western Blot检测心肌细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、OPA1、Drp1、p-Drp1、Pink1 及 Parkin 蛋白表达情况。3.实验三:构建Drp1慢病毒低表达载体（si-Drp1）,收集si-Drp1病毒颗粒感染原代心肌细胞,利用倒置荧光显微镜观察细胞转染情况,通过Western blot法检测测定Drp1蛋白转染效率,转染成功后,对转染后的原代SD大鼠心肌细胞进行缺氧复氧（6h/6h）,并进行随机分组:正常对照组（CTL组）、比索洛尔后处理组（BS组）、氯喹组（CQ）、缺氧/复氧组（H/R组）、缺氧/复氧+比索洛尔后处理组（H/R+BS组）、氯喹+缺氧/复氧组（CQ+H/R组）、氯喹+缺氧/复氧+比索洛尔后处理（CQ+H/R+BS组）,实验次数n=3;分别采用流式法检测原代心肌细胞凋亡指数,Western blot法检测原代心肌细胞LC3II/LC3I、Beclin1、Pink1及Parkin蛋白表达情况。结果:1.Evans blue-TTC双染显示心肌梗死程度（梗死面积/缺血面积,AI/AAR）:与I/R 组相比,I/R+BS 组心肌梗死面积减轻（0.31±0.021vs.0.44±0.031,P<0.05）,差别具有统计学意义;与CQ+I/R组相比,CQ+I/R+BS组心肌梗死面积减轻（0.41±0.031 vs.0.57±0.041,P<0.05）,差别具有统计学意义。2.超声心动图发现:与I/R组相比,I/R+BS组LVEF、FS升高（0.76±0.054vs.0.54±0.032,P<0.05;0.40±0.026vs.0.24±0.022,P<0.05）,LVEDV、LVESV降低（0.48±0.022vs.0.76±0.034,P<0.05;0.11±0.012vs.0.35±0.016,P<0.05）;与 CQ+I/R 组相比,CQ+I/R+BS 组 LVEF、FS 升高（0.64±0.032vs.0.50±0.052,P<0.05;0.30±0.012vs.0.19±0.016,P<0.05）,LVEDV、LVESV 降低（0.71±0.032vs.0.81±0.042,P<0.05;0.28±0.014vs.0.42±0.024,P<0.05）。3.通过TUNEL染色发现:与I/R组相比,I/R+BS组凋亡指数降低（15±1.0vs.27±1.2,P<0.05）;与 CQ+I/R 组相比,CQ+I/R+BS 组凋亡指数升高（26±1.6vs.38±2.2,P<0.05）;通过流式细胞检测发现,与I/R组相比,H/R+BS组凋亡指数降低（P<0.05）;与CQ+I/R组相比,CQ+H/R+BS组凋亡指数降低（P<0.05）。4.通过Western blotting可见:与IR组相比,IR+BS组心肌细胞LC3II/LC3I 比值、OPA1、Beclin1、Parkin及Pink1蛋白表达水平升高,p-Drp1的表达水平降低（P<0.05）。与 CQ+IR 组相比,CQ+IR+BS 组心肌细胞 LC3II/LC3I 比值、OPA1、Beclin1、Parkin及Pink1蛋白表达水平升高,p-Drp1的表达水平降低（P<0.05）。与 HR 组相比,HR+BS 组心肌细胞 LC3II/LC3I 比值、OPA1、Beclin1、Parkin及Pink1蛋白表达水平升高,p-Drp1的表达水平降低（P<0.05）。与CQ+HR组相比,CQ+HR+BS 组心肌细胞 LC3II/LC3I 比值、OPA1、Beclin1、Parkin 及 Pink1蛋白表达水平升高,p-Drp1的表达水平降低（P<0.05）。5.通过透射电镜可见,经缺氧/复氧（6h/6h）后,原代心肌细胞线粒体排列紊乱,线粒体发生肿胀,线粒体嵴断裂,线粒体自噬体减少;与HR组相比,比索洛尔后处理组线粒体损伤相对减轻,线粒体自噬体增多（P<0.05）。6.与空载体组相比,Drp1低表达组缺氧复氧诱导的原代心肌细胞凋亡减轻、线粒体自噬相关蛋白LC3II/LC3I比值及Beclin1、Parkin及Pink1蛋白表达量水平升高（P<0.05）;与Drp1空载体组相比,Drp1低表达组中比索洛尔进一步上调缺氧复氧诱导的心肌细胞LC3II/LC3I比值、Beclin1、Parkin及Pink1蛋白表达水平（P<0.05）。结论:通过本实验,我们发现比索洛尔可减少缺血再灌注所致的心肌损伤、减少心肌梗死面积、减轻心肌坏死程度,保护心脏功能;比索洛尔能通过增加线粒体自噬而减少缺血再灌注或缺/复氧诱导的心肌细胞损伤,其作用机制与Drp1/Pink1/Parkin通路相关,通过抑制Drp1丝氨酸637位点的磷酸化水平,提高了 Pink1、Parkin蛋白表达水平,从而增加心肌细胞的线粒体自噬而实现的。