畜牧生产中抗菌药的广泛使用会在畜禽体内以及养殖场周边形成亚抑菌浓度的抗菌药环境。亚抑菌浓度兽用抗菌药的使用引起的细菌耐药性问题受到人们的广泛关注,然而关于亚抑菌浓度兽用抗菌药的耐药产生条件和规律尚无系统研究。肠炎沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一,给全球的养殖业造成了巨大的经济损失并严重威胁人类的健康。恩诺沙星作为动物专用药,对畜禽的消化道疾病具有良好的治疗作用,兽医临床中常用于沙门氏菌病的防治。本课题以肠炎沙门氏菌为受试菌株,系统研究亚抑菌浓度恩诺沙星选择压力下沙门氏菌耐药产生的条件;并对不同浓度恩诺沙星诱导的部分耐药菌进行已知耐药机制检测和转录组学测序分析,旨在探究亚抑菌浓度恩诺沙星作用下沙门氏菌耐药发生的条件以及分子机制。1亚抑菌浓度恩诺沙星选择压力下沙门氏菌耐药发生条件的研究模拟养殖场及周边环境中不同亚抑菌恩诺沙星浓度环境,分别用1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC、1/64×MIC、1/128×MIC浓度的恩诺沙星体外诱导肠炎沙门氏菌CICC21527,每隔100代检测细菌在2～64×MIC浓度的恩诺沙星含药平板的耐药率。模拟不同温度(冷藏温度、室温、最适温度、畜禽体温)、畜禽不同消化道p H(胃p H、十二指肠p H、盲肠p H、回肠p H)、畜禽的小肠不同时间段的胆盐浓度(进食前后)、不同病菌感染剂量,设置不同温度(12℃、25℃、37℃、42℃)、p H(4.4、5.4、6.4、7.4)、胆盐浓度(0.1%、0.3%、1%、2%)、细菌接种量(10~2CFU/m L、10~5CFU/m L、10~8CFU/m L)等条件,在1/2×MIC恩诺沙星选择压力体外诱导沙门氏菌并检测耐药率。结果显示,在亚抑菌浓度范围内(1/128×MIC～1/2×MIC)随着恩诺沙星浓度的升高和诱导时间的延长,沙门氏菌的耐药率和耐药水平都升高。生长曲线结果显示:在亚抑菌浓度范围内,随着恩诺沙星浓度的增加沙门氏菌的生长受抑制程度增加,繁殖期延长;沙门氏菌的生长随着温度的升高生长越来越快,达到最适温度后则呈现下降的趋势,越接近最适温度增殖期越短;沙门氏菌的生长随着p H的增加而增加,繁殖期渐短;沙门氏菌的生长随着胆盐浓度的升高生长越来越快,达到最适胆盐浓度后则呈现下降的趋势,繁殖期延长;沙门氏菌的生长随着接种量的增加而呈现抑制趋势,繁殖期延长。1/2×MIC恩诺沙星选择压力下,随着p H的增加,沙门氏菌的耐药率和耐药水平增加;随着温度、胆盐、细菌接种量的增加,沙门氏菌的耐药呈现先增加然后下降的趋势。在亚抑菌浓度范围内沙门氏菌耐药的发生主要受恩诺沙星浓度、沙门氏菌菌群生长达到平台期的时间和诱导时间的影响,即恩诺沙星浓度越大、沙门氏菌的繁殖期越长和传代数越多,沙门氏菌的耐药率和耐药水平都较高。温度、p H、胆盐这三个因素对亚抑菌浓度选择压力下沙门氏菌的耐药的影响主要决定于菌群数量的大小,从而影响可供选择的菌体数,菌群数越大则耐药率越高。接种量对于沙门氏菌耐药发生的影响是低接种量下主要受接种量效应的影响,而高接种量下主要受菌群对数期的时间长短的影响。2亚抑菌浓度恩诺沙星诱导的耐药沙门氏菌的已知耐药机制的检测本研究对亚抑菌浓度范围内不同浓度恩诺沙星诱导的耐药沙门氏菌中氟喹诺酮耐药基因gyr A、gyr B、par C、par E的耐药决定区QRDR进行序列分析,并利用RT-PCR技术检测耐药菌株中膜孔蛋白(omp C、omp D、omp F)和氟喹诺酮外排泵相关基因(acr B、acr F、emr B、mdf A、mdt K)的表达水平。结果表明,经亚抑菌浓度恩诺沙星(1/2×MIC、1/8×MIC、1/32×MIC、1/128×MIC)诱导后得到的耐受2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC和32×MIC的耐药菌中都只出现了gyr A基因的突变,gyr B、par C及par E基因均未检测到突变。其中gyr A基因的突变位点以Ser83和Asp87为主,中低水平(≦8×MIC)的耐药菌不一定发生突变,而高水平(≧16×MIC)的耐药菌均发生突变。低水平耐药菌(≦4×MIC)中膜孔蛋白omp C、omp D、omp F的表达量减少,中高水平耐药菌(≧8×MIC)中外膜膜孔蛋白omp F的表达量减少。低水平耐药菌(≦4×MIC)中外排泵基因acr F和mdt K表达上调,acr B基因也在4×MIC耐药菌中表达上调;中高水平耐药菌(≧8×MIC)中外排泵基因acr B、emr B和mdf A的表达上调。故我们推测低水平耐药菌中以膜孔蛋白的缺失减少药物的摄入为主要耐药机制,其中以Omp F最为重要。随着耐药水平的升高外排泵和gyr A基因的突变逐渐成为主要的耐药机制。3亚抑菌浓度恩诺沙星筛选出的耐药沙门氏菌的转录组测序分析本研究采用高通量测序技术对1/2×MIC恩诺沙星诱导的32×MIC耐药菌(C组)、1/8×MIC恩诺沙星诱导的16×MIC耐药菌(D组)、1/128×MIC恩诺沙星诱导的8×MI C耐药菌(E组)与未诱导的亲本株(B组)进行转录组测序。转录组原始测序数据经处理后进行基因表达注释和差异表达基因的筛选(Foldchange≧2,P≦0.05)、GO分析、KEGG passway分析、蛋白互作网络分析、SNP分析、耐药数据库CARD比对分析。结果显示,C组与B组间有2040个差异基因,其中1032个基因表达上调,1008个基因表达下调;D组与B组之间有1497个差异基因,其中723个基因表达上调,774个基因表达下调;E组与B组间有1196个差异基因,其中644个基因表达上调,552个基因表达下调;C组与D组间有1785个差异基因,其中797个基因表达上调,988个基因表达下调;C组与E组间有1851个差异基因,其中852个基因表达上调,999个基因表达下调;D组与E组间有584个差异基因,其中296个基因表达上调,288个基因表达下调。转录组中沙门氏菌耐药菌gyr A和gyr B基因的表达上调且耐药水平越高表达量越高,呈现明显的量效关系,而par C和par E则表达量上调不显著。外排泵基因中acr A、acr B、acr E、emr B上调表达显著,tol C在32×MIC耐药菌株中的表达量显著上调,其他外排泵基因的表达量变化不显著。膜孔蛋白基因中除omp F表达下降外,其他基因的表达量则上调。耐药菌中共差异表达基因有573个,蛋白互作网络分析结果显示这些共差异的蛋白主要聚集在核糖体、精氨酸与脯氨酸代谢、代谢途径、嘌呤代谢、次生代谢物的生物合成、抗生素生物合成、输出蛋白、叶酸生物合成、牛磺酸和次牛磺酸代谢等代谢通路上。SNP分析结果显示,sfm H、gyr A和lig A基因在各个耐药水平的菌株中都发生突变。经与CARD数据库比对本研究共匹配出97种耐药相关基因,其中抗生素抗性基因79个,抗生素作用靶点基因23个,抗生素生物合成基因2个。与CARD数据库匹配的SNP和indel位点基因中3个耐药相关分别为bet I、ept A和gyr A,1个和耐药相关的indel位点为bet I。故omp F的表达量的下降,外排泵Acr AB的过表达,gyr A的突变以及gyr A和gyr B的表达上调是决定耐药的直接因素。综上在亚抑菌浓度范围内沙门氏菌耐药的发生主要受恩诺沙星浓度、沙门氏菌菌群生长的繁殖期长短和诱导时间的影响。低水平耐药菌中以膜孔蛋白的缺失减少药物的摄入为主要耐药机制,其中以Omp F最为重要;随着耐药水平的升高,外排泵基因的协调表达和gyr A基因的突变逐渐成为主要的耐药机制。本研究探究了亚抑菌浓度抗菌药诱导耐药菌的产生和耐药菌形成的条件,也对亚抑菌浓度下沙门氏菌耐药的分子机制进行了阐述,为亚抑菌浓度诱导的耐药菌的减缓及控制提供了理论与实践依据。