【摘 要】
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纤维素乙醇经历多年的发展和研究,仍然未能达到工业化生产要求,其原因包括纤维素酶成本高、纤维素酶的最适反应温度与纤维素乙醇生产菌株生长温度相差较大,微生物菌株对纤维素水解液中木糖利用慢以及对水解液中抑制物耐受性差等技术难题。Spathaspora passalidarum是近几年新发现的非常规酵母菌株,具有天然高效发酵木糖和葡萄糖生产乙醇的优势,但对纤维素水解液中抑制物耐受性和高温耐受性较差。本研究
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纤维素乙醇经历多年的发展和研究,仍然未能达到工业化生产要求,其原因包括纤维素酶成本高、纤维素酶的最适反应温度与纤维素乙醇生产菌株生长温度相差较大,微生物菌株对纤维素水解液中木糖利用慢以及对水解液中抑制物耐受性差等技术难题。Spathaspora passalidarum是近几年新发现的非常规酵母菌株,具有天然高效发酵木糖和葡萄糖生产乙醇的优势,但对纤维素水解液中抑制物耐受性和高温耐受性较差。本研究以S.passalidarum为研究对象,采用ORP调控、定向进化、外源添加化合物、基因工程改造多种策略提高其对抑制物的耐受性,使其能够适应不脱毒生产纤维素乙醇的发酵工艺,推动我国纤维素乙醇的产业化进程。首先,采用ORP调控策略评价S.passalidarum菌株发酵混合糖（葡萄糖:木糖=2:1）及添加有乙酸的混合糖的发酵情况。在不控制ORP的情况下,S.passalidarum菌株发酵混合糖时,存在明显的葡萄糖效应,木糖的消耗发生在葡萄糖被完全用完之后。添加抑制物后,S.passalidarum菌株的生长代谢受到严重抑制,对混合糖的消耗速率降低明显,葡萄糖效应更加严重。控制ORP在一定范围内,混合糖发酵效果明显改善,葡萄糖效应减弱,发酵时间缩短。尤其是添加抑制物后,调控ORP值控制通气量的方法可以显著提高S.passalidarum的发酵性能,增强对抑制物的耐受性。其中,ORP=-90 m V时发酵效果最优。其次,分别采用定向驯化的方式提高菌株的抑制物耐受性和高温耐受性。通过纤维素水解液定向驯化得到的菌株S.passalidarum-X,抑制物耐受性得到增强,并且一定程度上表现出对高温的耐受性。在高温条件下发酵时,较野生型菌株产生更少的木糖醇和更多的乙醇。但采用高温驯化获得的菌株,其抑制物耐受性反而下降。在培养基中加入脯氨酸、羟基丁酸等化学物质可以提高菌株高温耐受性。再次,本研究采用S.passalidarum和Kluyveromyces marxianus CICC 1727-5混菌发酵策略解除水解液抑制物对S.passalidarum发酵木糖的影响。采用两阶段发酵并控制1727-5和S.passalidarum的接种比例为1:100时,可提高含有抑制物的高浓度混合糖的发酵效果。最后,采用同源重组的方法,在S.passalidarum菌株中过表达了来源于马克斯克鲁维酵母（K.marxianus CICC-1727-5）的热激蛋白HSP26,获得重组菌株1710-HSP26。在高温发酵和添加抑制物的发酵实验中,1710-HSP26发酵能力均优于野生菌株,为后续进行不脱毒的纤维素水解液的同步糖化发酵奠定了基础。
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