【摘 要】
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根系作为植物的营养器官之一,起着吸收营养物质、固着和支撑等重要功能;同时根系对于植物响应非生物胁迫和生物胁迫具有重要作用,有些根可以形成变态根储存大量的营养物质。因此,研究根发育的分子机理将为作物的性状改良和培育抗逆高产、高效吸收营养物质的新品种提供理论支持。根尖分生组织（Root Apical Meristem,RAM）是植物地下部分的来源,活性氧（Reactive Oxygen Species
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根系作为植物的营养器官之一,起着吸收营养物质、固着和支撑等重要功能;同时根系对于植物响应非生物胁迫和生物胁迫具有重要作用,有些根可以形成变态根储存大量的营养物质。因此,研究根发育的分子机理将为作物的性状改良和培育抗逆高产、高效吸收营养物质的新品种提供理论支持。根尖分生组织（Root Apical Meristem,RAM）是植物地下部分的来源,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）和生长素在调控RAM发育方面发挥关键作用。ROS在RAM中处在一个动态平衡状态:H2O2促进干细胞分化,O2-持干细胞活性。生长素在根中呈梯度分布,通过调控PLT1、PLT2和WOX5等关键基因调控RAM发育。不同信号通路之间相互作用,将外部及内部因素整合到一起形成复杂的网络系统,共同调控干细胞维持、增殖和分化。铜胺氧化酶（Copper amine oxidases,CuAOs）催化降解生物体内的二胺生成γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid,GABA）、NH3和ROS等。有研究报道铜胺氧化酶参与植物维管、侧根、不定根的发育和气孔运动等。本课题前期实验发现CuAO5基因功能缺失突变体cuao5-2根尖分生区变小,主根发育异常导致生长缓慢,且该基因在拟南芥根中表达,说明CuAO5可能调控拟南芥主根发育。为了进一步解析CuAO5调控拟南芥主根发育的机制,本课题利用遗传学、生物化学、分子生物学及植物生理学等多种研究手段探究了 CuAO5调控拟南芥主根生长发育与ROS和生长素的关系。实验所得主要结果如下:1.通过观察pCuAO5:GUS-GFP转基因植株幼苗期GUS和GFP信号确定了CuAO5在拟南芥主根表达,但在根尖分生区未检测到表达;铜胺氧化酶基因家族有8个成员在拟南芥根中表达,其中仅CuAO6和AtAO1在根尖分生区有表达。2.CuAO5功能缺失突变体cuao5-2根尖分生区皮层细胞数目显著少于野生型,表明RAM区域显著变小,导致主根根长变短;其它CuAOs功能缺失单突变体未发现根发育异常。构建p35S:CuAO5超表达载体并将其转入cuao5-2获得转基因植株p35S:CuAO5/cuao5-2,观察发现转基因植株部分互补cuao5-2突变体根发育异常表型,说明CuAO5参与拟南芥主根发育。3.内源ROS的检测表明cuao5-2根尖ROS动态平衡破坏,与野生型相比H2O2积累量增加而O2-量减少。4.外源 H2O2清除剂 KI（Potassium iodide）、CAT（Catalase）、ASA（Ascorbic acid）及 MT（Melatonin）、RGF1p（Root Growth Factor）、GABA 和多胺合成抑制剂D-Arg（D-Arginine）处理cuao5-2均未能逆转其表型缺陷,暗示CuAO5调控主根生长与该酶的催化产物ROS和GABA以及该酶的催化底物多胺可能关系不大。5.通过比较cuao5-2和野生型背景下根尖DR5:GUS信号,发现突变体背景下根尖DR5:GUS信号减弱,结果表明CuAO5调控拟南芥主根发育依赖于生长素。6.通过比较cuao5-2和野生型背景下根尖pPLT1PLT1GFP、pPLT2:PLT2-EGFP和pPLT2:GFP信号,发现在突变体背景下GFP信号均减弱,表明CuAO5调控拟南芥主根发育依赖于PLT1和PLT2。7.通过比较cuao5-2和野生型背景下QC25:GUS和WOX5:GUS信号,结果显示在cuao5-2中QC25和WOX5转录因子的表达未受影响,说明CuAO5功能丢失未影响静止中心（Quiescent Centre,QC）的形态建成。综上所述,我们通过分析多个CuAOs功能缺失单突变体表型,结合生物化学、分子生物学和遗传学等手段,确定了 CuAO5调控拟南芥主根生长发育;进一步研究发现CuAO5功能丢失导致根尖分生区ROS动态平衡破坏、生长素含量减少且下游关键基因PLT1和PLT2表达量下降,初步确定CuAO5调控拟南芥主根生长发育依赖于生长素及下游关键基因PLT1PLT2,但其与ROS之间的关系还需进一步挖掘。
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