研究背景骨肉瘤是青少年与儿童最常见的原发恶性肿瘤之一,其发病部位主要累及股骨、胫骨等长骨骨骺端,由于骨肉瘤恶性程度高,具有肺部转移的高度倾向,因而,严重威胁着骨肉瘤患者的生存质量。近年来,随着临床骨肉瘤手术与化疗的联合应用,骨肉瘤患者的生存率逐步地提高,然而,令人遗憾的是,由于缺乏早期敏感与特异性的肿瘤标志物,骨肉瘤患者的诊断与治疗往往属于晚期阶段。此外,手术后骨肉瘤患者仍出现肿瘤的复发与远处转移。因此,寻求骨肉瘤高效的、高特异性与敏感度的肿瘤标志物,对骨肉瘤的早期诊断、术后监测、提高骨肉瘤患者生存率和生存质量具有重大的意义。研究目的本课题旨在探索miRNA-223在骨肉瘤中的诊断和预后价值,及其对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。通过临床与细胞水平研究,拟探讨以下几个问题:1,miRNA-223在骨肉瘤组织及癌旁正常组织、骨肉瘤患者及健康体检者外周血、骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞中的表达水平差异;2,评价血清miRNA-223作为骨肉瘤早期诊断肿瘤标志物的可能性;3,在细胞水平观察miRNA-223对骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭等的影响,探讨其下游靶向蛋白表达差异。为了血清miRNA-223作为临床骨肉瘤早期诊断的肿瘤标志物,及骨肉瘤的靶向基因治疗提供一定的理论基础。材料与方法1,骨肉瘤组织标本收集:选取郑州大学第一附属医院骨科从2009年7月至2012年7月收治的100例骨肉瘤手术切除的患者,并且征得手术患者的同意。所有骨肉瘤患者均切取骨肉瘤的原发癌组织,及周边无癌组织侵犯正常组织作为阴性对照,并且均经过病理证实。利用qRT-PCR测定骨肉瘤患者癌组织与癌旁组织miRNA-223表达水平。此外,收集骨肉瘤患者的临床病理信息,比较骨肉瘤患者组织miRNA-223表达水平与临床病理特征如:肿瘤的大小、淋巴转移情况、肿瘤浸润等关系。2,骨肉瘤患者血清标本:收集郑州大学第一附属医院骨科自2008年7月至2011年7月治疗的112例骨肉瘤手术切除患者的外周血,并且取得患者的同意,手术前抽取患者5mL外周血。此外,抽取同期50例健康体检者5mL外周血作为阴性对照,通过qRT-PCR比较骨肉瘤患者与健康体检者外周血miRNA-223表达差异,应用ROC曲线及多元生存分析,评价血清miRNA-223在骨肉瘤早期诊断及预后中的价值。3,在细胞水平,应用qRT-PCR比较骨肉瘤细胞系与正常成骨细胞系miRNA-223表达差异。此外,在骨肉瘤细胞系通过瞬时转染miRNA-223,利用MTT法、划痕实验及Transwell实验观察miRNA-223对骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响。此外,通过Western blot检测miRNA-223下游靶向分子Caprin-1的蛋白水平的变化。研究结果1,miRNA-223在骨肉瘤患者组织中的表达分析利用qRT-PCR检测miRNA-223在骨肉瘤组织及正常癌旁组织中的表达水平,结果显示骨肉瘤组织miRNA-223表达量显著低于癌旁正常组织,骨肉瘤癌旁正常组织miRNA-223表达量大约为骨肉瘤组织的3倍,两组比较差异具有显著统计学差异(P=0.0021)。这表明miRNA-223在骨肉瘤组织中呈现低表达,提示miRNA-223可能参与了骨肉瘤肿瘤的发生、发展。为了观察骨肉瘤患者组织中miRNA-223呈现低表达模式与骨肉瘤临床病理参数的关系,本研究通过比较骨肉瘤组织中miRNA-223在不同的患者性别、不同年龄、不同肿瘤大小、不同肿瘤位置、不同肿瘤组织类型、患者有无转移情况、不同生存情况等组别中的表达差异,结果显示死亡组、转移组骨肉瘤组织miRNA-223表达显著低于存活组、非转移组(P<0.05),提示miRNA-223可能在骨肉瘤转移与患者生存中发挥重要的作用。2,miRNA-223在骨肉瘤患者外周血中的表达分析通过qRT-PCR实验分析比较112例骨肉瘤患者与50例正常健康体检者血清中miRNA-223表达量。结果发现相对于正常健康体检者,骨肉瘤患者血清中miRNA-223表达量显著地下调,正常健康体检者血清中miRNA-223表达量约为骨肉瘤患者的4倍,两者比较差异具有显著统计学差异(P<0.01),进一步证实了miRNA-223可能参与了骨肉瘤肿瘤的发生与恶性的进展。为了探讨血清中miRNA-223是否可以作为骨肉瘤患者的一个早期诊断标志物,绘制ROC曲线结果显示,ROC曲线下面积为0.956,当根据约登数值设定截止值为1.76时,miRNA-223诊断骨肉瘤患者的特异性值为89.5%,敏感度值为97.2%,提示血清miRNA-223可作为一个潜在的生物标志物以区别骨肉瘤与健康体检者,具有较高的组织特异性及灵敏度。多元Cox回归分析结果显示,血清中miRNA-223表达(RR=4.59,95%CI 1.84-11.45,P=0.001)可作为骨肉瘤患者总体生存的一个独立预后因子。3,miRNA-223在骨肉瘤细胞侵袭中作用机制的初步探讨细胞水平,骨肉瘤细胞系瞬时转染过表达miRNA-223,应用MTT法、划痕实验及Transwell实验观察骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭的变化。MTT实验结果显示,相对于未转染的HOS、MG-63细胞及其阴性对照转染细胞,过表达miR-223可显著地抑制骨肉瘤细胞HOS、MG-63的增殖;划痕实验结果显示过表达miR-223可明显抑制骨肉瘤细胞HOS、MG-63的迁移;此外,Transwell实验显示过表达miR-223可显著抑制骨肉瘤细胞HOS、MG-63的侵袭。胞质激活/增殖相关蛋白1(Cytoplasmic activation/proliferation-associated protein-1,Caprin-1)是参与调节肿瘤细胞扩散率和细胞增殖率的重要蛋白。本研究中Western Blot实验结果显示,相对于空白细胞与阴性转染细胞,MG-63过表达miRNA-233后,Caprin-1蛋白表达水水平显著地被抑制;这提示miRNA-223/Caprin-1通路可能在骨肉瘤发生发展中起着重要作用。结论1,从骨肉瘤患者组织、外周血及骨肉瘤细胞系三个水平验证了miRNA-223在骨肉瘤中呈现低表达模式。2,血清miRNA-223可作为骨肉瘤患者早期有效的诊断标志物,具有高度特异性与敏感度。此外,血清miRNA-223还可以作为骨肉瘤患者手术后病情检测的一个指标。3,细胞水平研究发现miRNA-223可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭等生物学功能,miRNA-223可能通过调控Caprin-1进而发挥作用。