论文部分内容阅读
二酰甘油酰基转移酶(Acyl-Co A:diacylglycerol acyltransferase,DGAT)催化三酰甘油(triacylglycerol,TAG)生物合成最后一步酯酰化反应,即二酰甘油进一步酯酰化合成TAG。DGAT是决定碳源流向TAG的一个关键酶,在TAG合成与积累中起重要作用,已经成为油料作物改良、微生物油脂积累调控、人类肥胖症及二型糖尿病等脂质代谢综合征治疗的重要靶点。产油真菌卷枝毛霉(Mucor circinelloides)能够大量积累富含γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)的TAG,DGAT可能是其脂质代谢调控的又一个关键基因。但是至今有关卷枝毛霉脂质积累的研究主要是围绕脂肪酸合成,对TAG合成的关键基因DGAT的研究尚未见报道。本文旨在对卷枝毛霉4个DGAT(分别命名为Mc DGAT1/2/3/4)的基因鉴定和功能特性进行初步探索,从4个DGAT中鉴定出具有DGAT催化活性的Mc DGAT,研究其产脂特性,为揭示DGAT在卷枝毛霉TAG合成与积累中的作用以及为研究其对油脂积累调控奠定基础。首先,研究了卷枝毛霉的发酵培养和其4个DGAT在不同发酵时期的相对表达水平,结果显示,发酵培养14 h氮源耗尽,培养80 h后,卷枝毛霉细胞干重达到12 g/L,TAG约占细胞干重的6%,总脂约占细胞干重的10%;卷枝毛霉Mc DGAT的表达水平与其生长、产脂具有一定的相关性。其次,利用生物信息学方法分析了卷枝毛霉4个DGAT的结构与功能。比对了氨基酸序列,构建了分子进化树,同时预测了理化性质、二级结构、跨膜结构。研究发现,Mc DGAT1和Mc DGAT4属于DGAT2家族,相似性为68%,;Mc DGAT2和Mc DGAT3属于DGAT1家族,相似性为32%;且卷枝毛霉4个DGAT具有不同的理化性质、二级结构和跨膜结构,反应了功能的多样性与复杂性。再次,在缺陷型酿酒酵母中分别异源表达了卷枝毛霉4个DGAT。克隆了卷枝毛霉4个DGAT基因全长c DNA序列,构建了酵母表达载体p YES2-Mc DGAT1/2/3/4,并转化了缺陷型酿酒酵母菌株H1246,并分析了成功转化的4个Mc DGAT的相对转录水平,实现了卷枝毛霉Mc DGAT基因在缺陷型酿酒酵母内的异源表达。空质粒p YES2为阴性对照,酿酒酵母内源性DGAT基因Sc DGA1为阳性对照。最后,研究了重组酵母菌株的生长和产脂特点,并从4个Mc DGAT中鉴定出表现DGAT催化活性的Mc DGAT,并进一步探索了具有DGAT催化活性的重组酵母菌株在外源添加1 m M多不饱和的亚油酸(Linoleic acid,LA)或GLA时的产脂特点。研究发现,LA对除表达酿酒酵母内源性DGAT基因Sc DGA1和卷枝毛霉Mc DGAT4的重组菌株外的其余重组菌株均有生长抑制,GLA对所有重组菌株均无生长抑制现象。表达Mc DGAT4的重组酵母菌株可以合成与积累TAG,并恢复油体缺陷表型,且其TAG和总脂积累量明显大于表达Sc DGA1的阳性对照组。无外源添加脂肪酸时,表达Mc DGAT4的重组酵母菌株TAG和总脂分别是阳性对照组的1.8倍和1.1倍;相比于Sc DGA1,Mc DGAT4对C18:0更加偏好。外源添加1 m M LA时,表达Mc DGAT4的重组酵母菌株TAG和总脂分别是阳性对照组的2.5倍和1.9倍;相比于Sc DGA1,卷枝毛霉Mc DGAT4对各脂肪酸无明显的偏好。外源添加1 m M GLA时,表达Mc DGAT4的重组菌株TAG和总脂分别是阳性对照组的2.2倍和1.3倍;相比于Sc DGA1,Mc DGAT4对C18:1的偏好较差。Mc DGAT4对于外源添加的LA和GLA吸收利用率不同,相比于GLA,对外源添加的LA的利用率更高。