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目的:探讨糖基化脂肪来源干细胞对SD大鼠单穿支皮瓣神经再生的作用及可能机制,为促进临床皮瓣感觉恢复提供前期研究基础。方法:1.经患者知情同意并通过遵义医科大学伦理委员会批准后,从遵义医科大学烧伤整形外科正常人抽脂手术中获取皮下脂肪组织,利用Ⅰ型胶原酶消化机械离心分离,从正常人皮下脂肪中提取脂肪来源干细胞(ASCs),用含10%胎牛血清(FBS)+1%双抗的低糖DMEM(1g/L)培养基,在37℃、5%CO2恒温孵箱中进行培养,利用0.25%胰酶消化传代。2.取P3 nASCs进行鉴定,流式细胞仪检测细胞表面标志物CD105、CD90、CD73、CD45、CD44、CD34、CD11b、CD19及HLA-DR的表达情况。行成脂、成骨、成软骨诱导分化实验,分别用油红“O”、茜素红、阿利辛蓝染色鉴定成脂、成骨、成软骨诱导分化效果。3.取P3 nASCs,用含0.2%晚期糖基化终产物(AGES)、15%FBS+1%双抗的高糖DMEM(4.5g/L)的糖基化诱导培养基,在37℃、5%CO2恒温孵箱中进行培养,2-3天换液一次,连续诱导21天获得糖基化脂肪来源干细胞(gASCs)。4.分别收集nASCs和gASCs的上清液,酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测人脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、人神经营养因子3(NT-3)的表达。5.取72只8周龄SD雌性大鼠,每只大鼠腹壁制成1个原位回植失神经支配单穿支皮瓣,按随机数字表法,分为nASCs干预组、gASCs干预组、PBS干预组(NC组),每组24只,前两组大鼠皮瓣分别注射0.2mL nASCs和gASCs悬液,细胞数为1x10~6个,NC组单纯局部注射0.2mL PBS。6.分别于建模后即刻、注射后第10天和注射后第20天,取局部细胞移植部位皮瓣组织行组织学检查,利用S100免疫组织化学染色与PGP9.5免疫荧光染色评估皮瓣周围神经再生情况,利用Image J软件计算5个高倍镜镜下的阳性表达百分比。7.统计学分析实验结果采用均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行处理,组内多重比较方差齐性时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);两独立样本的比较采用独立样本t检验;且均以P值<0.05为有统计学意义。结果:1.约在12h后可见少量原代细胞贴壁,原代细胞生长速度较慢,呈长梭形或多角形,48h更换完全培养基后细胞生长速度加快,8-10d融合可达80%,传代后细胞生长速度明显增快,5-7天后可再次传代,流式细胞仪检测提取的细胞表面标记物结果显示CD44(98.5%)、CD73(99.96%)、CD90(97.09%)、CD105(98.00%)呈阳性表达,CD45/CD34/CD11b/CD19/HLA-DR(1.56%)呈表达阴性;经成脂、成骨、成软骨诱导分化后示提取的细胞具有成脂、成骨、成软骨细胞分化潜能,提示提取培养的细胞为脂肪来源干细胞。2.取P3 nASCs开始糖基化诱导培养,随着诱导时间延长,gASCs较nASCs增殖速度减慢,需7-9天才能进一步传代,而nASCs仍保持5-7天可再次传代,形态上gASCs形态与nASCs差异不明显,两者均呈放射样漩涡状生长排列。3.取P3代nASCs和gASCs分别收集两组细胞培养上清液,行ELISA检测BDNF、NGF、NT-3表达量,BDNF结果:gASCs分泌量为(1301.12±7.0)pg/mL,nASCs(1218.06±5.1)pg/mL;NGF结果:gASCs分泌量为(432.37±1.2)pg/mL,nASCs(399.59±0.7)pg/mL;NT-3结果:gASCs分泌量为(659.85±3.8)pg/mL,nACSs(638.45±1.6)pg/mL。gASCs组三种神经营养因子定量均高于nASCs组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.S100免疫组化结果显示:建模后即刻,各组间新生SC细胞阳性表达百分比无统计学差异(P>0.05);干预后第10天及20天,gASCs组、nASCs组均高于NC组,差异具有统计学意义(P<0.05),其中gASCs组高于nASCs组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.PGP9.5免疫荧光定量分析结果显示:建模后即刻,各组间新生神经纤维阳性表达百分比无统计学差异(P>0.05),干预后第10天及第20天,gASCs组、nASCs组均高于NC组,差异具有统计学意义(P<0.05),其中gASCs组高于nASCs组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.两种不同来源ASCs局部移植均可促进SD大鼠穿支皮瓣神经再生,机制可能与增多的雪旺氏细胞和神经纤维再生有关;2.相对于nASCs,gASCs更能促进SD大鼠穿支皮瓣神经再生,机制可能与分泌更多的BDNF、NGF、NT-3有关。