日本血吸虫病是由日本血吸虫感染所引起的人兽共患病，是我国的重点防治的传染性疾病之一，主要流行于长江流域以南的12个省、市、自治区，其中湖南、湖北、安徽、江西、江苏、四川及云南等7个省的疫情仍未得到完全的控制。我国的日本血吸虫病的防治足以综合防治为丰，结合吡喹酮药物治疗，但由于重复感染现象普遍，长期的应用可能产生耐药性，因此寻找新的药物作用靶标和疫苗是日本血吸虫病的研究重点之一。酶(enzyme)是由生物体内细胞产生的一种生物催化剂，大部分为蛋白质少数为RNA组成，在十分温和的条件下，高效率地催化机体中各种牛物化学反应，促进生物体的新陈代谢。因此，寻找日本血吸虫特异性酶类分子将为抗血吸虫病新药的筛选及疫苗的研制提供研究基础。 研究目的 建立本地化的日本血吸虫酶蛋白质序列数据库，通过生物信息学筛选、识别和实验分析，为日本血吸虫病疫苗研究及新药开发提供新的候选分子。 研究方法 1.日本血吸虫酶蛋白数据库的建立利用公共蛋白数据库采集日本血吸虫蛋白序列所含有的信息，从日本血吸虫蛋白序列中筛选出所有的日本血吸虫酶蛋白序列。根据蛋白的酶促性质以及GO分类方法对其分类，并将其gi号与分类进行关联，从而建立本地的日本血吸虫酶蛋白序列数据库。 2.日本血吸虫特异性酶蛋白的筛选与鉴定将日本血吸虫酶蛋白序列与本地的蛋白数据库进行BLAST比对，根据BLAST比对结果的特征，采用了相似性和E值两个指标对比对结果进行筛选，获得了6个可能的日本血吸虫特异性酶蛋白序列，并采用RT-PCR和生物信息学分析技术对其进行序列测定和分析。 3.日本血吸虫特异性酶蛋白GST10的生物信息学分析GST10是从特异性酶蛋白中筛选出来的一种新的酶蛋白，对其一级结构和拓扑结构、保守结构域、活性位点、抗原表位、二级结构和三级结构，直系及并系同源性进行了预测和分析。 4.GST10基因表达水平的研究利用半定量RT-PCR技术，对筛选出的GST10在日本血吸虫的成虫、虫卵、尾蚴期的基因表达水平做相对定量分析。同时制备多个单条成虫的cDNA，以此为模板对GST10及其同家族的日本血吸虫酶蛋白在不同虫体的基因表达水平进行检测。 5.GST10的重组表达及免疫学分析构建GST10重组蛋白原核表达体系，对表达的重组融合蛋白进行SDS-PAGE分析检测后，过层析柱纯化。收集重组蛋白的免疫鼠血清及自然情况下日本血吸虫感染人血清，利用Western-blot方法对重组融合蛋白的免疫原性与免疫反应性进行鉴定。 结果 1.共获得日本血吸虫酶蛋白序列2302条，并按照其信息采集的方式不同分为已知日本血吸虫酶蛋白序列162条和未知日本血吸虫酶蛋白序列2140条，在此基础上构建了完善的日本血吸虫酶蛋白分类系统，建立了本地日本血吸虫酶蛋白数据库。 2.确立了特异性日本血吸虫酶蛋白的筛选标准，与本地蛋白数据库进行比对后经筛选得到了6条日本血吸虫特异性酶蛋白。 3.采用RT-PCR方法对日本血吸虫特异性酶蛋白进行了鉴定，同时按照疫苗候选分子所应具有的特性从日本血吸虫特异性酶蛋白中筛选出了拥有GST_C家族结构域的特异性酶蛋白，并将其命名为GST10。 4.对GST10的基因表达水平的研究提示该蛋白在成虫、尾蚴的表达水平接近，明显高于在虫卵的表达水平。以单个体的成虫eDNA为模板的RT-PCR结果提示GST10在日本血吸虫成虫中呈现高水平的表达，且该蛋白与同家族酶蛋白GST28和GST26在催化活性上存在一定的协同作用。 5.通过原核表达系统得到了纯化的重组融合蛋白(re-GST10)，经Western-blot验证，re-GST10可以被自然情况下日本血吸虫感染人血清、重组的GST26免疫鼠血清及带6个His标签的重组GST10免疫鼠血清所识别，显示出该融合蛋白具有很好的免疫反应性。 结论 我们对2302个日本血吸虫酶蛋白进行了筛选，从中获得了6个特异性高的酶蛋白。对6个特异性酶蛋白的编码基因进行了鉴定和初步的分析后从中获得了一种具有GST_C家族结构域的酶蛋白，根据其分子量被命名为GST10。该蛋白在日本血吸虫的大部分时期都有基因水平的表达，可能参与了GST26或GST28异型二聚体的形成，从而促进GST26或GST28的酶活性。通过实验证实，我们获得纯化的重组蛋白具有很好的免疫反应性。本研究为日本血吸虫酶蛋白的研究添加了新的内容，并为GST10的进一步研究奠定了基础。