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兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease, RHD)对养兔业来说是一种威胁很大的的烈性传染性疾病,由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起,主要侵害2月龄以上的青壮年兔,造成的发病率和病死率都非常高,让家兔养殖行业的经济效益大幅降低。从2010年开始,欧洲地区出现了兔出血症病毒变异型,又称兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus tape 2, RHDV2),可造成30日龄以下幼兔和免疫兔瘟家兔的死亡,这一情况引起了养兔业的广泛关注。鉴于兔出血症病毒出现的变异情况及新的流行趋势,本试验通过对比分析RHDV,RHDV2的结构蛋白基因VP60,分别对RHDV, RHDV2的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法进行了研究,以期为RHD的快速检测诊断和分子流行病学调查提供科学技术工具。根据NCBI上登录的RHDV2 VP60基因序列设计6对引物,人工合成靶基因。将靶基因纯化回收,通过连接、转化构建重组质粒pMD19-T-RHDV2。根据靶基因序列设计1对简并引物,以阳性质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,建立关于RHDV2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并优化反应体系,进行特异性试验、重复性试验和灵敏性试验。用建立的方法对实验室人工感染样品(7份)和临床采集样品(15份)进行检测。试验结果显示建立的RHDV2检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好。该方法可检测的重组质粒pMD19-T-RHDV2的最低拷贝数为68个拷贝,该方法只能特异性的扩增RHDV2,对RHDV、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠杆菌和兔健康组织RNA的扩增结果均呈阴性,以阳性质粒为模板进行扩增得到的Ct值组内变异系数均小于0.8%,而该方法对RHDV人工感染样品和15份临床采集样品的检测结果均为阴性。通过比较分析NCBI上已登录的兔出血症病毒VP60基因序列,选择保守区设计一对特异性引物。提取RHDV阳性病料总RNA进行RT-PCR扩增,扩增出979bp大小的RHDV基因片段,并克隆到pMD19-T载体,构建重组质粒pMD19-T-RHDV。同时在扩增区内设计1对简并荧光定量PCR引物,目的片段大小为165 bp,以pMD19-T-RHDV为标准品进行荧光定量PCR扩增反应条件的优化和特异性试验、敏感性试验、重复性试验,建立了RHDV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。再利用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法对RHDV人工感染家兔(7只)进行检测并分析各组织器官的病毒含量,同时参照文献中的RT-PCR方法进行平行检测。试验结果表明建立的RHDV检测方法最低可检测的重组质粒pMD19-T-RHDV的拷贝数为81个拷贝,灵敏度优于RT-PCR方法。该方法只能特异性扩增RHDV, pMD19-T-RHDV2、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠杆菌和兔健康组织RNA的扩增均为阴性；以阳性质粒为模板进行扩增得到的Ct值在组内的变异系数均小于1.12%,说明该方法的敏感性高,特异性强,重复性好。对人工感染家兔各个脏器的检测结果表明脾脏的病毒含量最多,阳性检出率达100%,且可以根据各样品的Ct值计算出各脏器具体的含毒量,达到准确定量的效果。普通RT-PCR检测结果显示脾脏的条带最清晰,含毒量最多,与荧光定量PCR的检测结果基本相一致。