【摘 要】
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CRISPR-Cas是源于古细菌的一套免疫防御系统,自问世以来已逐渐发展为广泛应用于基因编辑、DNA组装、全基因筛选、基因表达调控以及核酸检测的有力工具。众多的CRISPR系统类型中,CRISPR-Cas12a的成熟cr RNA序列及二级结构具有极高的保守性,再加上其简单的结构和高效的功能,研究者们也对此投入了较多的关注与研究。Cas12a蛋白作为一种潜在的药用蛋白质,其免疫原性将成为未来基因治疗
【基金项目】
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内外联动协同促进sTRAIL抗肿瘤作用的肿瘤微环境触发式融合蛋白的构建及效应机制研究（基金编号:81660583）； 表皮调节素EREG参与胶质母细胞瘤抵抗双氢青蒿素治疗的作用机制研究（基金编号:81860531）；
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CRISPR-Cas是源于古细菌的一套免疫防御系统,自问世以来已逐渐发展为广泛应用于基因编辑、DNA组装、全基因筛选、基因表达调控以及核酸检测的有力工具。众多的CRISPR系统类型中,CRISPR-Cas12a的成熟cr RNA序列及二级结构具有极高的保守性,再加上其简单的结构和高效的功能,研究者们也对此投入了较多的关注与研究。Cas12a蛋白作为一种潜在的药用蛋白质,其免疫原性将成为未来基因治疗领域所面临的主要问题。我们希望通过对该蛋白的B细胞表位进行研究和探索,为Cas12a蛋白的免疫学性质研究提供一定理论基础。本研究中,以毛螺菌属ND2006来源的Lb Cas12a为主要研究对象,首先通过诱导表达原核系统BL21/p ET28a-His-Lb Cas12a得含His标签的Lb Cas12a融合蛋白,提取、分离纯化后免疫动物,获得效价及特异性均良好的抗Lb Cas12a的多克隆抗体。而后,综合了B细胞表位相关的亲水性、表面可及性、柔性、抗原性及β-转角等氨基酸性质,利用生物信息学的多参数机器学习工具预测得该蛋白的9个候选线性B细胞表位。最终,将候选表位肽LBE系重组至含GST标签的原核表达载体中,诱导表达、提取纯化得GST-LBE系融合蛋白,在体外对其抗原性进行鉴定并筛选出3个优势表位,分别为LBE1:754EELVVHPANSPIANKNPDNPKKTTTLSYDVY784,LBE5:475GEGKETNRDESFYGDFVLAYDILLKVDHIYD505,LBE7:19FKAIPVGKTQENIDNKRLLVE39。再以3个优势表位的GST标签融合蛋白作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,验证其在体内的免疫原性,辅以3D结构的空间位置分析对优势表位进行评价得LBE1及LBE5为Lb Cas12a蛋白的最优势B细胞表位。综上,本研究制备出了抗Lb Cas12a的多克隆抗体,并预测、筛选鉴定出Cas12a蛋白的线性B细胞表位,验证其抗原性及免疫原性。研究结果为进一步解析Cas12a蛋白的结构和功能提供了一定的基础,同时也可为后续蛋白质的改造和应用提供一种新思路。
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