【摘 要】
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蛋白质广泛参与到生物体的各项生命活动中,但是新生肽链必须折叠成特定的结构才能发挥其功能,蛋白质的错误折叠是导致许多疾病的重要原因。在许多蛋白质折叠的过程中,分子伴侣常常发挥重要的作用。来源于大肠杆菌的伴侣素GroEL及其辅因子GroES,是一类非常关键的分子伴侣,许多研究已经证明分子伴侣GroEL-GroES能够辅助多种水溶性蛋白的折叠。近期,本课题组的研究表明,分子伴侣GroEL-GroES也能
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蛋白质广泛参与到生物体的各项生命活动中,但是新生肽链必须折叠成特定的结构才能发挥其功能,蛋白质的错误折叠是导致许多疾病的重要原因。在许多蛋白质折叠的过程中,分子伴侣常常发挥重要的作用。来源于大肠杆菌的伴侣素GroEL及其辅因子GroES,是一类非常关键的分子伴侣,许多研究已经证明分子伴侣GroEL-GroES能够辅助多种水溶性蛋白的折叠。近期,本课题组的研究表明,分子伴侣GroEL-GroES也能辅助膜蛋白的折叠,对于膜蛋白的产量及活性都有着明显的促进作用,这一发现对于膜蛋白的合成具有重要的意义。目前对于GroEL-GroES如何辅助膜蛋白的折叠还不清楚,因此难以对这一折叠过程进行进一步的调控。本论文以具有七次跨膜α-螺旋结构的细菌视紫红质为模型,研究GroEL-GroES辅助膜蛋白折叠的过程,期望在阐明这一折叠过程的同时,为调控膜蛋白的折叠提供实验基础。本论文中,我们利用单分子荧光技术,考察了GroEL-GroES在细菌视紫红质折叠中的作用机制,包括其对细菌视紫红质折叠/去折叠中分子构象动态变化的影响。第2章,我们在实验室前期的工作基础上,成功制备了细菌视紫红质BR（0CV130C）、脱辅基细菌视紫红质BO（0C-249C）两个双定点突变体,利用荧光染料AF488和AF647对突变体蛋白进行荧光双标记,对标记后的蛋白样品表征的结果表明双标记成功。还成功制备了GroEL、GroES等蛋白,为下一步利用单分子荧光共振能量转移（sm-FRET）、荧光相关光谱（FCS）等技术研究GroEL-GroES对细菌视紫红质折叠的影响奠定了基础。第3章,我们探索了GroEL/GroES/ATP的不同组合与变性态BR（0C-V130C）和天然态BR（0C-V130C）相结合的动力学和热力学情况,发现ATP作为激活剂,能大大促进GroEL与变性态底物蛋白BR的疏水结合,从而促进对变性态蛋白的重折叠。同时,我们认为ATP、GroES和ATP-GroES能够分别对GroEL的结构产生不同的影响,导致GroEL对特定底物亲和性的变化。热力学实验表明,变性态BR与分子伴侣GroEL结合的亲和力高于天然态BR。第4章,我们利用荧光相关光谱法研究了BR分子自发复性、在GroEL辅助下复性以及GroEL-GroES介导下的BR复性。发现变性态BR分子自发复性时很容易发生聚集,这不利于其折叠成正确的天然状态。分子伴侣GroEL能与容易聚集的变性态BR结合,并且疏散聚集态BR分子。而GroEL-GroES同时存在时,对聚集态的BR分子疏散作用更为明显。GroEL-GroES通过结合BR折叠中间体,减少非天然态BR聚集,从而更有利于底物蛋白折叠成其天然状态。同时,利用单分子荧光共振能量转移技术对BO突变体折叠/去折叠中分子构象的动态变化进行表征,发现BO分子去折叠过程中存在多个不同的集合。BO分子自发复性过程缓慢且复性产率低。GroEL介导BO复性过程中,复性速率有所提高,但是复性产率很低。辅因子GroES和激活剂ATP的合作可以更大化地疏散聚集的BO,从而最大程度地提高变性态BO的折叠速率和折叠效率,并可以再生GroEL活性,促进变性态BO重折叠。
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