【摘 要】
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奶牛乳腺炎是奶牛乳腺的炎性反应,作为奶牛四大疾病之一,其严重影响了奶牛的健康。乳腺上皮细胞是乳房中乳汁的合成场所,更是血乳屏障的主要构成者。在乳腺炎的发生过程中,乳腺上皮细胞通过诱发炎症而保护周围组织,但过量的炎症反应则往往会损伤乳腺。炎症反应通常由炎症因子调节,乳腺中已检测出多种炎症因子,但乳腺炎中炎症因子的功能尚未被确切知道。同种异体移植炎症因子-1（Allograft Inflammator
【基金项目】
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四川省科技计划项目（2019JDJQ0017）“金黄色葡萄球菌肠毒素在牦牛乳腺炎发生发展中的作用”；
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奶牛乳腺炎是奶牛乳腺的炎性反应,作为奶牛四大疾病之一,其严重影响了奶牛的健康。乳腺上皮细胞是乳房中乳汁的合成场所,更是血乳屏障的主要构成者。在乳腺炎的发生过程中,乳腺上皮细胞通过诱发炎症而保护周围组织,但过量的炎症反应则往往会损伤乳腺。炎症反应通常由炎症因子调节,乳腺中已检测出多种炎症因子,但乳腺炎中炎症因子的功能尚未被确切知道。同种异体移植炎症因子-1（Allograft Inflammatory Factor-1,AIF-1）是一种主要在激活的巨噬细胞和T淋巴细胞中表达、分泌的炎症因子,其在免疫调节中扮演重要角色。本研究探索了AIF-1对牛乳腺上皮细胞炎症因子的释放以及细胞活力影响。主要研究内容如下:（1）利用ELISA试剂盒检测了乳腺炎奶牛牛乳中AIF-1的含量,结果显示患乳腺炎奶牛牛乳中AIF-1的平均含量显著高于健康奶牛,而抗生素治愈后的奶牛牛乳中AIF-1的含量回落到正常水平。这一结果提示牛AIF-1是一个分泌型蛋白,可能与乳腺炎相关。（2）为了探索AIF-1与奶牛乳腺炎的确切关系,本实验利用RT-PCR克隆了牛AIF-1基因,并对其编码的氨基酸序列进行分析,预测了AIF-1蛋白的基本理化特性以及蛋白信号肽和跨膜区域。结果显示该基因编码一个147个氨基酸的多肽,含有一个QXXER基序和一个Ca2+结合的EF-Hand,分别位于19-23位氨基酸和58-69位氨基酸,与人AIF-1蛋白具有87.76%的相似性,提示了其也可能具有免疫调节的功能。预测AIF-1蛋白相对分子量为16.86 k Da,分子式为C744H1209N195O228S10;理论等电点PI为5.98,总平均亲水性为-0.690,为碱性亲水类蛋白质;体外半衰期为大于30 h,不稳定系数为59.05,为结构较不稳定的蛋白质。接着将AIF-1克隆片段连接至p ET-32a（+）质粒中,获得重组质粒p ET-32a（+）-AIF-1,然后转化至表达工程菌株后使用IPTG诱导目的蛋白表达,最后通过镍离子亲和层析法对AIF-1重组蛋白进行纯化。经SDS-PAGE检测,使用含100 mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱带有His标签的目的蛋白时,所获得的AIF-1重组蛋白纯度较高。（3）分别用浓度为0、0.1、1、10 nmol/L的牛AIF-1蛋白处理牛乳腺上皮细胞（MAC-T）48小时后,ELISA检测发现其上调了牛乳腺上皮细胞中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1的分泌,并刺激了IκBα的磷酸化。而IκBα磷酸化抑制剂BAY 11-7085阻断了牛AIF-1刺激的炎性细胞因子上调。这一研究提示牛AIF-1是通过核因子κB信号促进了牛乳腺上皮细胞炎症因子的释放。（4）为了进一步解析牛AIF-1与奶牛乳腺炎的关系,将牛AIF-1处理乳腺上皮细胞48小时后,利用CCK-8、乳酸脱氢酶酶活测定、Annexin V-FITC/PI染色、活性氧、ATP含量、线粒体膜孔复合物检测试剂盒分别测量了牛乳腺上皮细胞的活力、胞外乳酸脱氢酶酶活、细胞凋亡比例、活性氧、ATP的产生和线粒体膜孔复合物的打开。使用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,western blot检测caspase 3的裂解。结果显示牛AIF-1损伤了牛乳腺上皮细胞的活力,增加了上皮细胞的膜通透性,促进了细胞的坏死。并刺激了细胞氧化应激,激活了caspase 3,继而诱发了细胞凋亡。同时,牛AIF-1打开了线粒体膜孔复合物,造成线粒体膜去极化和ATP产生受阻。因此,牛AIF-1损伤了乳腺上皮细胞,这种损伤可能是由于线粒体功能障碍而引发。综上所述,本研究明确了牛AIF-1通过激发牛乳腺上皮细胞的炎症反应并损伤牛乳腺上皮细胞的活力,从而参与了奶牛乳腺炎的发生。
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