论文部分内容阅读
目的：核苷酸类似物阿德福韦酯是临床常用的抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)药物,然而长期使用会导致耐药的发生。经典的阿德福韦酯耐药变异形式为rtN236T和rtA181V,关于rtN236位点尚未见其他耐药相关变异的报道。本研究旨在鉴定分析两例阿德福韦酯治疗失败的慢性乙肝患者HBV逆转录酶(reverse transcriptase, RT)区新变异rtN236V的表型耐药特点。方法：1.分别从两例阿德福韦酯治疗失败的慢乙肝患者血清中提取HBVDNA,采用巢式聚合酶链反应(PCR)扩增HBV RT区,分别将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体,患者1挑选16个克隆,患者2挑选34个克隆进行DNA测序并分析与耐药相关的突变形式。2.用Xho Ⅰ/Sph Ⅰ双酶切pGEM-Teasy RT克隆载体及pTriEX-HBV(C)1.1倍表达载体,构建1.1倍HBV野生株和耐药株的重组载体。3.将重组后的载体质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞,转染4h后分别加入不同浓度的拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替诺福韦酯,隔天更换含不同药物浓度的培养液,转染后第四天收集细胞培养液,然后采用实时荧光定量PCR方法检测在不同药物浓度作用下细胞培养上清液中HBV DNA的产量,并分析其表型耐药特点。分别进行三次独立重复实验。结果：1.患者1接受阿德福韦酯治疗20个月后出现病毒学突破和生化学突破,之后加用拉米夫定治疗6个月后再次出现生化学突破,此时患者血清HBV DNA RT区克隆测序结果显示16个克隆中,13个(81.25%)为rtN236V变异株,2个(12.5%)为rtN236T突变株,1个(6.25%)为野生株。患者2经阿德福韦酯单一治疗15个月后效果不佳,出现病毒学突破和生化学突破,此时患者血清HBV DNA RT区克隆测序结果显示34个克隆中,20个(59%)为rtN236V变异株,11个(32%)为rtN236T变异株,2个(6%)为野生株,1个(3%)为rtA181V+N236V变异株。2.分别获取经过Xho I/Sph Ⅰ双酶切后的pGEM-Teasy RT区及pTriEX-HBV(C)1.1载体,经连接、转化等步骤成功构建1.1倍HBV重组载体质粒。3.分别将构建好的重组载体质粒转染入HepG2细胞中,表型耐药结果分析显示：患者1：rtN236T和rtN236V变异株的相对病毒复制力分别为野生株的84.76%,80.02%；患者2:rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V变异株的相对病毒复制力分别为野生株的89.43%,83.60%和66.44%；在体外实验中,患者1和患者2分离的rtN236V变异株与野生株相比对阿德福韦酯的敏感性分别降低了3.90倍和3.10倍,rtN236T变异株与野生株相比对阿德福韦酯的敏感性分别降低了4.50倍和4.75倍,从患者2分离的rtA181V+N236V变异株与野生株相比对阿德福韦酯的敏感性降低了5.10倍,而三种变异株对拉米夫定、恩替卡韦和替诺福韦酯均敏感。结论：首次在阿德福韦酯长期治疗失败的慢乙肝患者血清病毒池中鉴定新的变异形式rtN236V,并与rtN236T和rtA181V株伴随存在,表型耐药结果显示rtN236V变异在一定程度上降低了病毒的复制力,同时也降低了病毒对阿德福韦酯的敏感性,提示该变异是一种新的阿德福韦酯耐药相关变异。