以往对BCG抗肿瘤作用的研究主要集中于膀胱癌，恶性黑色素瘤等，但在人卵巢癌方面的研究，国内外均少见报道，其对卵巢癌治疗的可行性、有效性、作用机制等均有待于深入研究。 实验目的： ①探讨BCG及其提取成分卡介苗多糖核酸(BCG-polysaccaridenucleicacid，BCG-PSN)是否有直接抑制卵巢癌细胞生长作用；②探讨BCG及BCG-PSN对人外周血的免疫刺激作用：主要包括a.探讨BCG能否促使外周血单核细胞(monocytes，MNC)向成熟DCs转化；b.探讨BCG能否促使外周血淋巴细胞(Lymphocytes，LCs)增殖活化为BAK细胞，从而发挥抗卵巢癌作用。 第一部分 BCG及其成分直接抗卵巢癌作用的研究材料和方法 1.靶细胞人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株(HO-8910)。 2.靶细胞形态观察调节HO-8910细胞浓度为1×105/ml，接种于24孔板中；每孔分别加入1ml活BCG(viableBCG，V-BCG)、热灭活BCG(non-viableBCG，NV-BCG)3.0×103～108集落形成单位(colony-formingunits，cfu)/ml、BCG-PSN0.035-350ug/ml，每组设3个复孔；同时设靶细胞空白对照；使效应分子与靶细胞分别作用24、48、72小时。显微镜下观察靶细胞形态改变并摄像。 3.MTT还原法检测卵巢癌细胞的生长抑制率调节HO-8910细胞浓度为1×105/ml，取100ul接种于96孔板中；每孔分别加入100ul不同浓度V-BCG、NV-BCG(3.0×103～108cfu/ml)及BCG-PSN(0.035-350ug/ml)作用不同时间(24、48、72小时)，每组设3个复孔；并设靶细胞对照及效应分子对照；用MTT还原法检测492nm波长处各孔光密度值(opticaldensity，OD)。按下述方法计算HO-8910细胞的生长抑制生长抑制率(％)=靶细胞OD-(实验孔OD-效应分子OD)/靶细胞OD×100％4.统计学分析三部分实验结果均利用SPSS10.0forWindows统计软件包进行相关分析和统计，所有数据用X±SD表示；统计方法包括：t检验、双变量相关分析、单因素方差分析；以P＜0.05作为差异的标准。 结果 1.光镜改变随着V-BCG浓度增加(＞3.0×104cfu/ml)及作用时间延长(＞24h)，HO-8910细胞损伤加重，表现为细胞增殖变缓，细胞变圆，体积缩小，细胞表面见许多折光性强的小体，细胞浆内出现颗粒状物质，最后膜破裂、崩解、坏死。而NV-BCG及BCG-PSN引起HO-8910损伤的形态学改变明显轻于V-BCG，主要表现为细胞折光性下降，细胞增殖变缓，细胞浆内出现颗粒状物质。 2.HO-8910细胞生长抑制率V-BCG与卵巢癌细胞作用浓度达到＞0.3感染分数(multiplicitiesofinfection，moi)，NV-BCG＞30moi，BCG-PSN＞350mg/m时，卵巢癌细胞生长抑制率超过20％；且V-BCG与NV-BCG对卵巢癌细胞的生长抑制作用均随其浓度的增加而增强；其抗卵巢癌活性：V-BCG＞NV-BCG＞BCG-PSN。 第二部分 BCG促进外周血单核细胞向成熟树突状细胞转化的研究 材料和方法 1.MNC分离培养经密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs)，通过贴壁法得到MNC。调节MNC浓度1×106/ml，分别加入V-BCG(3×104cfu/ml)、NV-BCG(3×104cfu/ml)及BCG-PSN(35ug/ml)培养7天；相差显微镜及扫描电镜观察各组细胞形态并摄像。 2.流式细胞仪(flowcytometry，FCM)检测DCs细胞表面成熟抗原用CDla、HLA-DR、CD83、CD86荧光抗体标记经V-BCG刺激后的DCs，FCM检测荧光抗体的表达率。 结果 1.DCs细胞形态观察光镜及扫描电镜观察到，经V-BCG及NV-BCG刺激后形成形态典型的DCs；而BCG-PSN组与对照组比较细胞形态无明显改变。 2.培养前后的DCs表型FCM分析在V-BCG组MNC可分化为成熟的DCs，DCs的相关抗原呈高表达：CD1a(81.78±12.51)％、CD83(50.22±20.69)％、CD86(79.49±9.77)％、HLA-DR(86.73±5.34)％，与培养前比较P＜0.01，均显著升高。 第三部分 BCG激活外周血淋巴细胞抗卵巢癌作用活性研究 材料和方法 1.LCs分离培养贴壁法得到悬浮的LCs；调节LCs浓度1×106/ml，分别加入效应分子rIL-2(1000u/ml)、V-BCG(3×104cfu/ml)、NV-BCG(3×104cfu/ml)及BCG-PSN(35ug/ml)共同培养7天后产生相应的效应细胞，分别为LAK、活卡介苗激活杀伤细胞(V-BCGactivatedkillercells，V-BAK)、非活卡介苗激活杀伤细胞(NV-BCGactivatedkillercells，NV-BAK)、卡介苗多糖核酸激活杀伤细胞(BCG-PSNactivatedkillercellsP-BAK)；实验中设未加效应分子的对照LCs组；通过显微镜观察细胞形态并摄像；细胞计数各效应细胞增殖情况。 2.MTT法检测效应细胞杀伤活性调节HO-8910细胞浓度为1×105/ml，每孔100ul接种于96孔板中；按效靶比40：1，20：1，10：1分别加入五种相应的效应细胞LAK、V-BAK、NV-BAK、P-BAK和LCs各100ul；每组设3个复孔；并设靶细胞对照及效应细胞对照；培养24小时后，MTT还原法检测效应细胞对HO-8910细胞的杀伤活性，计算公式同第一部分。 3.FCM检测V-BAK中NK比率用CD3，CD16_CD56荧光抗体标记培养7天的V-BAK细胞，FCM检测V-BAK中表型为CD3-/CD16+_CD56+NK细胞的表达率。 结果 1.不同效应细胞培养7天后增殖倍数分别为：LAK(13.16±1.36)倍、V-BAK(9.76±0.82)倍、NV-BAK(4.42±0.65)倍、P-BAK(3.09±0.36)倍，与对照LCs(1.50±0.39)倍比较，均明显增殖(P＜0.05)。 2.各效应细胞对HO-8910细胞的杀伤活性比较同一效应细胞在不同效靶比对靶细胞的杀伤率，以40：1效靶比时最高(P＜0.01)；相同效靶比下，各效应细胞对靶细胞的杀伤率均高于对照LCs组(P＜0.01)；在40：1效靶比时，LAK及V-BAK对靶细胞的杀伤率分别为(64.79±6.62)％、(54.88±3.51)％，两者抗卵巢癌活性相当(P＞0.05)；在40：1效靶比时，NV-BAK及P-BAK对靶细胞杀伤率分别是(35.60±5.19)％和(27.44±4.53)％，显著低于LAK及V-BAK(P＜0.05)。 3.FCM检测结果LCs表型为CD3-/CD16+_CD56+的NK细胞比率(12.80±8.21)％；V-BAK细胞中表型为CD3-/CD16+_CD56+的NK细胞比率为(30.60±11.15)％，显著高于培养前(P＜0.05)。 结论 1.一定浓度V-BCG、NV-BCG及BCG-PSN对人卵巢癌细胞HO-8910的生长有直接抑制作用，且随着V-BCG及NV-BCG浓度的增加，对卵巢癌细胞的生长抑制作用有增强的趋势。V-BCG的抗卵巢癌活性强于NV-BCG及BCG-PSN。 2.V-BCG和NV-BCG可直接诱导外周血单核细胞转化为成熟的DCs，BCG-PSN无促进外周血单核细胞向成熟的DCs转化的作用。说明V-BCG和NV-BCG具有潜在的激活人体特异性免疫功能的作用。 3.V-BAK细胞的抗卵巢癌细胞活性与LAK细胞相似；经V-BCG激活的淋巴细胞中，NK细胞的比率明显增高，抗卵巢癌活性增强。该实验结果为V-BCG局部的免疫治疗卵巢癌提供了实验依据。