免疫分析具有快速、简便、经济、灵敏、高通量等特点,非常适合农药残留的快速筛查。农药残留免疫分析方法通常采用竞争模式,竞争抗原是该模式免疫分析的必需试剂。噬菌体展示多肽技术可快速的研制农药等小分子的模拟表位多肽,用作竞争抗原建立竞争免疫分析,提高分析敏感性。生物淘选,即将目标噬菌体展示多肽从多肽库中分离的过程,是研制模拟表位多肽的核心步骤,但是目前常用的淘选策略经常造成目标噬菌体在淘选程序中丢失,降低了模拟表位多肽的研制成功率。本研究针对目前常用的淘选策略造成目标噬菌体丢失的关键性因素不明,以有机磷农药模拟表位多肽为研究对象,（1）通过定点突变和计算机辅助模拟,明确模拟表位多肽与抗体的互作机制;（2）基于互作机制构建噬菌体展示突变库,通过高通量测序,探明造成目标噬菌体在淘选程序中丢失的关键性因素,为农药等小分子化合物模拟表位多肽研制方法的完善提供理论基础。主要研究结果如下:（1）利用M13KE噬菌体载体,对有机磷农药模拟表位多肽（CPPWPLRPGC,两端半胱氨酸形成二硫键成环）进行单位点的定点丙氨酸（A）突变,使用噬菌体酶联免疫吸附分析（ELISA）评价突变体的活性,发现三号位脯氨酸（P）、四号位色氨酸（W）、五号位P和七号位精氨酸（R）突变成A后不能与抗体结合,多肽失去活性;二号位P、六号位亮氨酸（L）、八号位P和九号位甘氨酸（G）突变成A后,仍可以与抗体特异性的结合,具有活性。在此基础上,对二、六、八和九号位的氨基酸进行2点、3点和4点的A突变,发现突变体均具有活性。此外,挑选三号、六号和九号位进行非A的定点突变,结果显示三号位突变成苯丙氨酸（F）、W或组氨酸（H）后失去活性;六号位突变成谷氨酰胺（Q）、赖氨酸（K）、天冬酰胺（N）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）,九号位突变成F、H、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、N后,突变体均具有活性。通过与另一种有机磷农药模拟表位多肽CAPWPPRPGC 比对,发现六号位的非关键氨基酸为α-亚氨基酸（P）时,也可与抗体特异性结合。因此,有机磷农药模拟表位多肽的核心序列为PWPXR（X为任意氨基酸）。与含有核心序列PWPXR的模拟表位多肽CSPPWPPRPC比对,发现核心序列在多肽中的位置可以变动,但是固相合成只含有核心序列的五肽（PWPAR）不具有活性,说明非核心位点的氨基酸可以改变,但是不能缺失。通过固相合成闭环（形成二硫键）和开环（不形成二硫键）的模拟表位多肽CAPWPLRPGC,经ELISA测定,发现两者均具有活性,说明成环不是决定模拟表位多肽具有活性的关键因素。综上,有机磷农药模拟表位多肽的核心序列为PWPXR（X为任意氨基酸）,并且该核心序列在多肽中的位置可以变动;非核心位点氨基酸可以改变,但是不能缺失;多肽两端的半胱氨酸是否成环不决定多肽的活性。采用基因克隆技术得到了抗有机磷农药单克隆抗体可变区氨基酸序列,经PDB数据库比对后,选择编号4HXA和1EZV分别为抗体轻链和重链的模板,进行同源建模,Verify Score和Procheck评价结果显示同源模建的结构合理可靠。采用多条模拟退火动力学从头模拟（SA-MD）的方法构建有机磷农药模拟表位多肽的结构,Procheck和Zscore评价结果显示结构合理可靠。使用Autodock和Gold进行分子对接,发现模拟表位多肽结合在 Tyr35、Tyr53、Asn60、Arg100、Tyr162、Ser169 构成的活性口袋中,形成一定的弱相互作用。同时,三号位P、四号位W、五号位P和七号位R的四个氨基酸残基与抗体形成了氢键作用。这些弱相互作用力大大降低了模拟表位多肽与抗体结合的自由能,并使该构象更加稳定。然而,分析物甲基对硫磷结合在Tyr34、Trp48、Tyr51、Tyr108、Phe109构成的疏水腔中,与Phe109具有一定的T-π相互作用,与Tyr108具有π-π相互作用,而且与Asn36形成了氢键相互作用。虽然模拟表位多肽和分析物与抗体结合时的弱作用力不同,但是模拟表位多肽的结合口袋与分析物结合的疏水腔基本重合。研究结果明确了模拟表位多肽核心序列PWPXR与抗体的互作机制;解析了模拟表位多肽作为竞争抗原的机理。（2）基于模拟表位多肽与抗体互作机制的研究结果,利用噬菌体展示系统构建了核心序列特征（CXPWPXRXXC,X 为任意氨基酸）和非核心序列特征（CAXXXAXAAC,X为任意氨基酸）的噬菌体展示多肽突变库。其中核心序列特征突变库的插入率达到100%,转化阳性克隆数为1.28×107 pfu,约为理论库容量的12倍,扩增后滴度为8.54×1013 pfu/mL;非核心序列特征突变库的插入率为90%,转化克隆数为2.07×107 pfu,其中阳性克隆数为1.86×107 pfu,约为理论库容量的18倍,扩增后滴度为7.0×1013 pfu/mL。对突变库的高通量测序结果表明,突变库基本涵盖了所有的理论序列。使用抗有机磷农药单克隆抗体分别对两个突变库及两者1:1混合的突变库进行亲和淘选,结果显示从核心序列特征突变库和混合库中均能淘选获得大量阳性克隆,并且均含有核心序列;未能从非核心序列特征突变库中获得阳性克隆。该结果符合模拟表位多肽与抗体互作机制的结论。收集核心序列特征突变库和混合库淘选程序中各操作步骤的噬菌体进行高通量测序（除杂、孵育、淋洗、洗脱、扩增）。经过序列种类和丰度的比对,发现扩增会使序列种类显著降低,序列的丰度发生显著性的变化,说明噬菌体的遗传偏好性会导致阳性序列的丢失或阳性序列丰度的降低。此外,洗涤也会导致亲和力较弱或丰度较低的多肽丢失:基于分析物的梯度定向竞争洗脱可以排除一些亲和力过高的多肽（会导致竞争免疫检测灵敏度低）。因此,影响目标噬菌体展示多肽丢失的主要因素为噬菌体的遗传偏好性和多肽与抗体互作的亲和力。根据研究结果推测,后期淘选策略应采取尽可能避免噬菌体遗传偏好性的淘选策略,比如利用噬菌粒展示系统。