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养血清脑颗粒是以中药名方四物汤（《和剂局方》方）的基础上由11味中药材加减方组成,临床用于治疗血虚肝亢所致缺血性脑血管病,具有滋阴补血、平肝潜阳、活血通络之功用。养血清脑颗粒的临床疗效显著,但其发挥作用的主要物质基础、作用机制及制剂的质量控制标准研究仍存在不足。本研究以中药整体观为指导思路,采用多种分析方法与技术手段进行养血物质基础与质量控制方法研究,内容如下:1.养血清脑颗粒化学质量评价方法与化学成分鉴定分析建立了 30批养血清脑颗粒样品280 nm UPLC数字化指纹图谱,采用系统指纹定量法对得到的指纹信息进行整体性评价,揭示出养血清脑颗粒UPLC数字化指纹图谱特征。采用UPLC/Q-TOF-MS结合UPLC/IT-MSn分析技术对养血指纹图谱中64个共有峰进行系统的鉴别,并对主要大类成分的裂解规律以及峰归属进行归类分析。同时采用指纹图谱结合化学计量学技术筛选影响制剂质量稳定性的化学成分,建立基于8指标成分定量的养血清脑颗粒质量一致性评价方法;该方法准确、快速,从中药复方化学成分质量一致性层面提出一种简单可行的质控方法。2.养血清脑颗粒入血成分分析及相关药效成分药动学研究采用UPLC/Q-TOF-MS技术对灌胃给予养血清脑颗粒后大鼠入血成分进行定性分析,通过比较养血清脑颗粒提取液、给药血浆和空白血浆的提取离子流色谱图,共鉴定出来自于8种药材的28个原型成分入血,其中包括7种酚酸,4种单萜苷,9种生物碱和8种蒽醌类化合物。大鼠口服给予养血清脑颗粒后,建立了同时测定大鼠血浆中7种生物碱的UPLC-MS/MS法,以地西泮为内标,采用蛋白沉淀法对样品处理后,在ESI（+）模式下选择多反应离子检测（MRM）分析。色谱条件为选择Phenomenex Kinetex C18（100×2.1 mm,2.6 m）色谱柱,流动相（0.1%甲酸水-乙腈）,流速:0.3 mL/min;梯度洗脱。血浆中7种生物碱在线性范围内关系良好（r＞0.9923）,定量下限（LLOQ为0.02 ng/mL）;日内、日间精密度的相对偏差（RSD）在15%之内;相对误差在-2.7%～8.3%之间;待测物和内标的回收率及基质效应均在要求范围之间。灌胃给予养血清脑颗粒后,7种生物碱的药时曲线均呈双峰现象,分析认为这种现象可能与多种机制或因素有关:其中主要考虑因肝肠循环相关,另外,也可能与胃肠吸收的不齐性、药物在组织分布后的再吸收、药物制剂因素或制剂中其他成分的配伍影响等相关。建立了同时测定3种酚酸、4种苷类和3种蒽醌类成分的UPLC-MS/MS法,以氯霉素为内标,选择蛋白沉淀法对样品前处理后,在ESI（-）模式下选择多反应离子检测（MRM）分析。血浆中10种化合物在线性范围内关系良好（r＞0.9923）,定量下限（LLOQ为0.03 ng/mL）;日内、日间精密度的相对偏差（RSD）在15%之内;相对误差在-9.2%～14%之间;待测物和内标的回收率及基质效应均在要求范围之间。负离子模式下的10种成分药动学过程均符合二室模型,体内吸收较迅速,0.88h内均达到峰值。通过对养血清脑颗粒入血成分及主要入血成分体内动态变化规律研究,为阐明养血清脑颗粒的药效物质基础提供了依据。3.养血清脑颗粒对斑马鱼神经元保护药效活性研究首次采用标准化的斑马鱼神经元损伤药效模型,应用神经凋亡细胞荧光强度定量分析探讨养血清脑颗粒对体内神经细胞保护药效活性,同时利用蛋白组学中iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术筛选出与神经元损伤相关的差异表达蛋白质,初步探讨养血清脑颗粒对脑血管疾病治疗效果和相关作用机制。结果表明,养血清脑颗粒对斑马鱼中枢神经系统有很显著的保护作用,在NOAEL（1000 μg/mL）下的神经保护药效为（59.0±3.54）%,与模型组相比,统计学差异显著（p＜0.001）。通过蛋白组学分析,共筛选出32个与神经元相关差异蛋白,经生物信息学分析,筛选出的差异蛋白主要参与代谢、细胞骨架形成、神经元细胞形成和神经元离子通道过程等;经过蛋白质印记法验证,共推测出Ef1-α和α-6-F两个预后生物标志物,可作为养血清脑颗粒对斑马鱼神经元损伤保护预后的标志物;该研究结果为进一步揭示养血清脑颗粒治疗脑血管疾病的作用机制打下了基础。4.养血清脑颗粒生物活性质量控制方法初探采用吗替麦考酚酯（MTT）诱导的斑马鱼神经元损伤药效模型对养血清脑颗粒进行神经细胞保护生物活性评价和质量稳定性检测。结果表明,斑马鱼神经损伤模型作为心脑血管药物生物学内控检测方法具有较好的精密度（日内RSD为2.2～3.7%,日间RSD为1.2%）稳定性（RSD为4.9%）和重复性（RSD为8.4%）,方法学考察符合生物活性测定指导原则的要求。在对不同特征来源的样品评价中:正常样品均具有显著的神经保护作用（神经保护率:55.8～61.3%）,过期制剂样品及特殊制剂的神经保护效率显著降低,表明该方法可用于区分合格与不合格样品。采用斑马鱼神经元损伤模型评价养血清脑颗粒的神经细胞保护作用,方法快速、稳定可靠;可作为现有质量控制方法的有效补充,并为中药的生物活性质量控制研究提供一定的技术参考。