基于多组学联合分析初步解析不同分子水平玉米光周期敏感机制

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热带、亚热带玉米含有特异的遗传变异,是拓宽国内玉米种质,丰富遗传基础和加快育种工作进程的有效途径。然而由于受光周期敏感性的影响,热带、亚热带玉米在温带条件下推迟开花,甚至不进行生殖生长,严重制约了该种质在国内的引进及利用。因此,开展光周期敏感途径中核心基因的发掘及调控网络机制的研究将为我国种质资源的开发和利用提供重要的理论及现实意义。本研究以光周期钝感自交系黄早四及Zm CCT近等基因系(NIL;光周期敏感自交系)为材料,通过蛋白组、m RNA-Seq和mi RNA-seq的联合分析,初步探讨了长日照条件下的光周期敏感机制及其与其他生物路径的互作网络调控。同时利用高代回交群体,通过全基因组56K SNP芯片扫描及KASP标记分型技术进行进一步精细定位,鉴定出了影响光周期敏感的候选基因,Zm PIF3。针对该候选基因,采用原位杂交和q RT-PCR技术分析了黄早4及Zm PIF3近等基因系(PIF3-NIL)中Zm PIF3的时空表达规律;利用酵母双杂交技术及CO-IP-质谱联合分析的方法,筛选出与Zm PIF3相互作用的两个候选蛋白,为进一步研究Zm PIF3介导的光周期互作网络机制提供了研究基础。同时,利用新兴的Hi-C技术并联合RNA-Seq及Chip-Seq测序技术,以热带自交系CML288和温带自交系D132为材料,初步解析了热带与温带种质在全基因组水平上的染色质构象差异,为理解两个种质之间的表观学差异打开了新的思路并奠定了研究基础。综上所述,本研究主要通过多组学联合分析的方法,在不同分子水平(全基因组范围内的DNA、RNA及蛋白水平)解析了光周期敏感的分子调控机制。主要研究结果如下:1、以高代回交群体(BC8F4)为材料,利用全基因组56k芯片及KASP基因分型技术,通过进一步精细定位,鉴定了位于标记S769和S777之间90kb范围内的光周期敏感候选基因,Zm PIF3。通过观察黄早4及其近等基因系PIF3-NIL的表型差异,我们发现在LD(郑州)种植的条件下,PIF3-NIL抽雄期及散粉期比黄早4延迟。但是,在SD(海南)条件下,PIF3-NIL与黄早4的开花表型(抽雄、散粉期)无显著差异,表明Zm PIF3是一个光周期敏感基因。通过q RT-PCR定量,长日照条件下CML288和PIF3-NIL中Zm PIF3的表达量显著低于黄早4,而短日照条件下,三个材料间的表达量差异不显著,暗示了Zm PIF3基因可能是一个开花促进因子。另外,通过酵母双杂交及CO-IP-质谱分析的方法,找到了两个候选互作蛋白-GRMZM2G162529(phosphoribulokinase precursor)和GRMZM2G474769(MYB family transcription factor)为进一步了解Zm PIF3在玉米光周期敏感调控网络中的功能提供了研究基础。2、在长日照条件下,以光周期敏感近等基因系CCT-NIL和钝感自交系黄早4作为材料,利用i TRAQ-lable方法,在两材料中鉴定出5259种光周期响应蛋白和943个差异蛋白;GO-KEGG功能网络富集分析显示,差异蛋白主要富集在20个功能类别中,主要富集在与能量代谢相关的功能(核糖体、乙醛酸、二羧酸代谢、L-苹果酸脱氢酶活性)。结果表明两自交系间光周期敏感性差异可能影响了玉米体内能量代谢水平和糖类的积累。3、利用高通量m RNA测序(RNA-seq)和i TRAQ-lable联合分析方法,分析黄早4与CCT-NIL从营养生长到生殖生长过渡期间的转录和蛋白水平变化。结果显示,CCT-NIL和黄早4中58.9%和55.8%的差异蛋白与生物过程相关,主要包括五个主要GO类别:代谢过程,对刺激的响应、运输、植物发育和繁殖以及细胞发育,而鉴定的差异基因主要参与磷离子转运和光合作用过程。重要的是我们发现m RNA表达量及其编码蛋白质的积累量之间存在极其弱的相关性(r~2=0.002~0.02),证明转录后调控机制涉及光周期敏感介导的发育阶段转换诱导。4、mi RNA对其靶基因的调控被认为是植物体内转录后调控的一种重要方式。为了进一步了解转录后调控机制在光周期路径中的作用,mi RNA-Seq测序被用来鉴定响应玉米光周期敏感反应的mi RNA。在黄早4和CCT-NIL中,113和134个差异mi RNA分别在叶片和茎尖中被鉴定,其中mi R399d在两个材料间的差异最显著,暗示了光周期敏感性影响mi R399的表达;在缺磷条件下,mi R399表达量在两个自交系中均被显著提高。而在外源蔗糖处理条件下,两自交系中,mi R399d的表达量与对照相比均显著降低,但在CCT-NIL中mi R399的表达与黄早4相比更低,这些结果显示外源蔗糖可以抑制mi R399的表达,而光周期敏感自交系CCT-NIL可能对蔗糖的响应更加敏感;通过测定两自交系中可溶性糖和磷含量,发现与黄早4相比,CCT-NIL中含有较高的蔗糖含量,表明CCT-NIL中mi R399的较低表达水平可能是受外源及内源蔗糖的共同作用,而两个自交系中显著不同的磷含量及磷转运基因PHT4;1,则表明光周期敏感机制可能影响了mi RNA399介导的磷离子转运机制;利用mi RNA-array技术筛选了拟南芥中响应外部蔗糖调节的mi RNA,结果表明mi R399的表达在拟南芥和玉米中均会被蔗糖抑制。5、为研究热带和温带种质之间表观遗传调控的差异,我们以热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系D132为材料,通过高分辨率染色质捕获技术(Hi-C)、RNA-Seq及Chip-seq联合分析的方法,首次重建了玉米细胞核内染色体结构的空间三维模型,并首次发现玉米中A/B组分在三维空间呈现彼此分离的分布特点。D132和CML288之间的全基因组Hi-C比较分析显示,大约8%的染色质组分和60%的拓扑结构域(TAD)发生了重组。结合RNA-Seq分析,我们发现大量基因的转录水平在组分转换区域及TAD重组区域均发生了显著变化。此外,利用Hi-C与H3K4me3的Chip-Seq联合分析的方法,我们发现组蛋白修饰的变化可能导致D132和CML288之间的染色质相互作用的差异。本研究首次揭示了热带和温带玉米自交系之间全基因组水平染色质结构特征的差异,为其他物种间的比较Hi-C分析提供了参考。
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