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目的:砷是地球上最常见的非金属元素之一,对全球健康构成重大威胁。已有流行病学和动物研究显示砷暴露会对免疫系统产生损伤。巨噬细胞作为天然免疫系统的重要组成部分,不仅吞噬病原体以及死亡的细胞碎片,还可以分泌不同类型的细胞因子以及参与抗原递呈过程。研究表明砷负调控巨噬细胞吞噬功能和粘附性。自噬是细胞内消除错误折叠蛋白和维持蛋白稳定的主要机制之一,TFEB是自噬和溶酶体生物发生的关键调节因子。除了调控细胞稳态外,自噬在先天免疫系统和适应性免疫系统中的作用也备受关注。越来越多的研究开始关注自噬对巨噬细胞吞噬作用和粘附性的可能影响。本研究选取亚砷酸钠作为暴露因素,首先观察无机砷暴露对J774A.1单核巨噬细胞的吞噬功能、粘附性、以及核转录因子TFEB和自噬-溶酶体途径相关蛋白LC3、p62、LAMP 1、CTSB、CTSL等的可能影响;进而,通过建立TFEB低表达的tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞稳转模型,深入探讨TFEB介导的自噬在无机砷影响巨噬细胞功能中的可能调控作用。研究方法:1、J774A.1单核巨噬细胞的培养和分组:小鼠J774A.1单核巨噬细胞常规培养传代。分组和染毒情况具体如下:tfeb-sgRNA转染前:中性红染色实验为As3+（0.5、1、2μM）处理巨噬细胞12、24和36 h。其余实验均为As3+（0.5、1、2μM）处理巨噬细胞24 h。分组为con组、0.5μM NaAsO2组、1μM NaAsO2组和2μM NaAsO2组。tfeb-sgRNA转染后:所有实验均为1μM As3+处理巨噬细胞24 h。分组为NC-sgRNA组、tfeb-sgRNA-1组、tfeb-sgRNA-2组以及tfeb-sgRNA-3组。2、细胞吞噬功能检测:中性红染色法。3、细胞粘附性检测:结晶紫染色法。4、Western blot蛋白免疫印迹检测:提取细胞全蛋白,按照试剂盒说明书进行蛋白质浓度测定;蛋白变性后,上样、电泳、转模、封闭以及孵育一抗和二抗,分别检测TFEB、LC3、p62、CTSB、CTSB、LAMP 1和β-actin的蛋白表达。5、慢病毒转染和稳转细胞系建立:根据预实验MOI值以及最适嘌呤霉素剂量,将状态良好的小鼠J774A.1单核巨噬细胞转染NC-sgRNA、tfeb-sgRNA-1、tfeb-sgRNA-2、tfeb-sgRNA-3病毒及相应促转染剂;24h后观察细胞状态正常,更换普通培养基,待稳定后添加浓度为2μg/ml Puromycin,继续培养并进行传代、冻存。6、细胞活力检测:CCK-8法。7、统计学分析:应用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析,各组间差异的比较运用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05为差异具有统计学意义。结果:1、无机砷对J774A.1单核巨噬细胞吞噬功能的影响本实验用0.5、1以及2μM无机砷分别处理巨噬细胞12 h、24 h和36 h,通过中性红染色法检测巨噬细胞的吞噬能力。结果表明在无机砷处理12 h后,与con组相比,仅有2μM剂量组对细胞吞噬功能有明显抑制（P＜0.05）。不同浓度无机砷处理24 h后,与con组相比,1μM和2μM剂量组细胞吞噬率出现抑制作用（P＜0.05）。在无机砷处理巨噬细胞36 h后,与con组相比,各剂量无机砷均会抑制细胞的吞噬功能（P＜0.05）。2、无机砷对J774A.1单核巨噬细胞粘附性的影响在0.5、1和2μM无机砷分别处理细胞24 h后,用结晶紫染色法检测了巨噬细胞的粘附性。实验结果表明,与con组相比,1μM和2μM的无机砷处理会抑制巨噬细胞的粘附性,具有统计学差异（P＜0.05）。3、无机砷对J774A.1单核巨噬细胞自噬溶酶体途径的影响本实验用0.5、1和2μM无机砷处理巨噬细胞24 h后收集全蛋白。Western blot检测结果显示,与con组相比,无机砷处理使TFEB蛋白表达升高（P＜0.05）;与con组相比,各剂量组LC3-Ⅱ蛋白水平升高,且在无机砷浓度为1μM和2μM时,LC3 Ⅱ蛋白表达升高明显（P＜0.05）;与con组相比,无机砷处理组p62蛋白表达均升高（P＜0.05）;与con组相比,2μM无机砷处理的LAMP 1的蛋白表达水平升高（P＜0.05）;与con组相比,无机砷使溶酶体组织蛋白酶CTSB和CTSL的蛋白表达升高,其中1μM和2μM剂量组蛋白表达升高明显（P＜0.05）4、tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞模型的建立根据确定的最适MOI以及最适嘌呤霉素浓度建立TFEB低表达tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞稳转模型,并用Western blot检测小鼠J774A.1单核巨噬细胞中的TFEB蛋白水平,tfeb-sgRNA组TFEB蛋白表达水平显著低于con组和NC-sgRNA组（P＜0.05）;随后利用CCK-8法检测tfeb-sgRNA慢病毒转染对小鼠J774A.1单核巨噬细胞细胞活力的影响,结果显示与con组相比,NC-sgRNA组、tfeb-sgRNA-2组以及tfeb-sgRNA-3组细胞活力无统计学差异（P＜0.05）。5、无机砷对tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞自噬溶酶体途径的影响1μM无机砷处理tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞24 h后,与NC-sgRNA+As组相比,tfeb-sgRNA-2+As和tfeb-sgRNA-3+As的TFEB蛋白表达均显著降低（P＜0.05）;与NC-sgRNA+As组相比,tfeb-sgRNA-2+As组LC3-Ⅱ蛋白表达升高（P＜0.05）;与NC-sgRNA+As组相比,tfeb-sgRNA-2+As和tfeb-sgRNA-3+As组巨噬细胞p62进一步升高（P＞0.05）。无机砷处理24 h后,与NC-sgRNA+As组相比,tfeb-sgRNA-2+As和tfeb-sgRNA-3+As组的LAMP 1表达进一步降低（P＜0.05）;与NC-sgRNA+As组相比,tfeb-sgRNA-2+As和tfeb-sgRNA-3+As组中CTSB蛋白表达水平也明显降低（P＜0.05）。6、无机砷对tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞吞噬功能的影响1μM无机砷处理tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞24 h后,检测各组细胞吞噬率。中性红染色法实验结果表明,在未给予无机砷处理时,与NC-sgRNA组相比,tfeb-sgRNA-2和tfeb-sgRNA-3组可显著降低巨噬细胞的吞噬能力（P＜0.05）;在给予无机砷处理时,与NC-sgRNA+As组相比,tfeb-sgRNA-2+As和tfeb-sgRNA-3+As组中细胞吞噬率显著下降（P＜0.05）。7、无机砷对tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞粘附性的影响1μM无机砷处理tfeb-sgRNA J774A.1单核巨噬细胞24 h后,检测各组细胞粘附率。结晶紫染色法实验结果表明,在未给予砷处理组中,与NC-sgRNA组相比,tfeb-sgRNA-2和tfeb-sgRNA-3组细胞粘附率无统计学差异（P＞0.05）;在给予无机砷处理组中,与NC-sgRNA+As组相比,tfeb-sgRNA-2+As和tfeb-sgRNA-3+As组中细胞粘附率增加（P＜0.05）。结论:1、无机砷抑制小鼠J774A.1单核巨噬细胞的吞噬功能和粘附性,并影响巨噬细胞的自噬溶酶体途径。2、TFEB介导的自噬溶酶体途径可能在无机砷影响巨噬细胞吞噬功能和粘附性中具有一定的调控作用。