论文部分内容阅读
目的:众所周知,大气细颗粒物(PM2.5)的来源主要包括工业废气和机动车尾气排放、燃煤及建筑烟尘,是评价大气污染的标志性污染物。随着中国经济的迅猛发展,由大气细颗粒物引起的环境污染问题日渐突出,空气污染已成为严重危害公众健康的第四位危险因子。PM2.5暴露可通过呼吸进入机体,引起呼吸道疾病的发生发展,因此,对颗粒物的毒性效应及机理研究也逐渐成为国内外众多学者所关注的焦点。本实验以宁夏永宁、青海西宁、河北石家庄和四川绵阳四个不同地域的PM2.5降尘为研究对象,以体外培养的A549细胞为受试细胞,通过PM2.5降尘急性暴露于A549细胞建立染毒细胞模型,分析PM2.5降尘对A549细胞的毒性作用及对细胞周期改变的影响,并探讨其可能存在的毒性效应机制,为进一步推动我国环境健康研究奠定坚实基础。方法:（1）将研磨后PM2.5降尘制成粉尘悬液,利用激光粒度分析仪检测其粒径分散情况;将烘干的样品制成粉尘压片,借助XRD进行物相分析。（2）取处于指数生长期且生长状态良好的A549细胞接种于96孔板中,分别加入200μL浓度分别为0（细胞对照组）、12.5、25、50、100和200μg/mL共6个浓度的PM2.5降尘悬液,继续培养12、24和48 h。MTT法检测A549细胞存活率并分析其与降尘浓度的相关性,同时设定空白对照组及粉尘对照组。（3）将A549细胞接种在内置灭菌爬片的12孔板中,加入100μg/mL的PM2.5降尘悬液,同时设定对照组。染尘培养24 h后取出爬片,固定后进行W-G染液染色,油镜观察细胞形态。（4）将A549接种于12孔板中,分别以0、12.5、25、50、100和200μg/mL的PM2.5悬液进行染毒,同时,将A549细胞接种于共聚焦培养皿中,加入100μg/mL的PM2.5悬液,均共培养24 h。利用荧光探针DCFH-DA避光孵育标记细胞后,荧光分光光度计测定平均荧光水平,共聚焦显微镜留取荧光图片,并分析胞内ROS水平与细胞活力的相关性。（5）将A549细胞接种于6孔板中,加入100μg/mL的PM2.5降尘悬液,同时设定对照组。共培养24 h后收集并固定细胞,PI染色后立即测定细胞周期改变情况。（6）基于PM2.5降尘暴露所致A549细胞周期阻滞,继续用PM2.5降尘以100μg/mL的浓度染毒A549细胞后,利用RT-PCR检测细胞周期阻滞相关基因p53、p21、CDK1、c-myc及lncRNA H19的表达水平,Western-blot检测周期蛋白Cyclin B表达。（7）在前期染毒模型基础上,通过转染H19 siRNA干扰H19的表达,RT-PCR检测其对p53、c-myc及CDK1表达的影响,探讨PM2.5诱导细胞周期阻滞过程中lncRNA与mRNA之间的相互作用,为研究PM2.5诱导细胞周期阻滞的机制奠定坚实基础。结果:（1）永宁、西宁、石家庄及绵阳地区的降尘经纯水分散后大多数粒径≤2.5μm,粉尘颗粒D90值分别为2.011、2.208、2.423、2.397μm。PM2.5降尘中除主相石英外,西宁和石家庄组降尘掺杂方解石、钠长石和白云石等,永宁组掺杂钠长石和白云石,绵阳组主要掺杂方解石。（2）与对照组相比,四组PM2.5降尘浓度从12.5μg/mL增加到200μg/mL时,相同处理时间下,细胞增殖活力随染毒浓度升高而降低,同时,在维持处理浓度相同的条件下,细胞增殖活力随暴露时间增多而呈现递减趋势,表现出良好的剂量-效应及时间-效应关系。（3）与对照组相比,PM2.5降尘作用后,细胞培养液中出现较多悬浮的死亡细胞及细胞碎片,染毒组细胞表面吸附较多粉尘细颗粒,部分细胞轮廓消失、胞膜溶解、出现细胞微核及虫蚀样空洞破坏。（4）与对照组相比,四个染尘组A549细胞胞内ROS水平均呈增加趋势,且随染毒浓度增加而递增。四组PM2.5降尘作用后,均可见到不同程度的细胞损害,受损细胞荧光强度明显增高。此外,永宁、石家庄和绵阳组的胞内ROS水平增加程度与细胞活力下降程度存在显著相关性。（5）与对照组相比,四个地域PM2.5处理A549细胞后,处在S期的细胞数无明显变化,处在G0/G1期的细胞数降低,而处在G2/M期的细胞数则显著增加,提示细胞在G2/M期停留时间延长从而诱导细胞增殖阻滞。（6）与对照组比较,永宁、西宁、石家庄和绵阳地区PM2.5作用于细胞24 h后,细胞G2/M期阻滞相关基因p53、p21、c-myc及H19表达上调,CDK1及cyclin B1表达则下调。（7）转染H19 siRNA后成功干扰H19的表达,并调控p53、c-myc及CDK1基因的表达进一步降低,其中西宁染毒组对基因表达抑制最显著。提示lncRNA H19与c-myc可配对共同扩增发挥作用,通过与p53结合参与细胞周期进程,干扰H19低表达使细胞G2/M期阻滞更加明显。结论:（1）不同地域PM2.5降尘作用于A549细胞均可破坏细胞形态,抑制细胞增殖。（2）不同地域PM2.5降尘作用于A549细胞刺激胞内ROS生成增多,诱导细胞内氧化损伤,干扰细胞周期细胞代谢活性。（3）不同地域PM2.5降尘作用于A549细胞后可通过激活p53及p21活性,抑制CDK1和cyclin B1表达水平,从而诱导细胞G2/M期阻滞。（4）短期暴露于不同地域PM2.5降尘后,lncRNA H19在A549细胞中可能发挥特异性癌基因的作用,通过与p53及c-myc结合参与细胞周期进程。