【摘 要】
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蛋白纯化技术被广泛应用于生物、医药、食品等领域,其中亲和层析是一种简单而有效的方法。亲和层析具有特异性强,效率高的优点,但是同时也具有一定缺陷,比如需在目标蛋白上融合亲和标签。亲和标签能提供特异性的识别能力,但是也会对蛋白的后续使用产生一定影响。使用内含肽作为亲和标签,则减少了这样的麻烦。断裂内含肽在空间上分为N端（IN）和C端（IC）,将断裂内含肽的IN和IC分别作为纯化配体和纯化标签,可以在进
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFC1603202/2018YFC1603200）；
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蛋白纯化技术被广泛应用于生物、医药、食品等领域,其中亲和层析是一种简单而有效的方法。亲和层析具有特异性强,效率高的优点,但是同时也具有一定缺陷,比如需在目标蛋白上融合亲和标签。亲和标签能提供特异性的识别能力,但是也会对蛋白的后续使用产生一定影响。使用内含肽作为亲和标签,则减少了这样的麻烦。断裂内含肽在空间上分为N端（IN）和C端（IC）,将断裂内含肽的IN和IC分别作为纯化配体和纯化标签,可以在进行纯化的同时切割亲和标签,简化了纯化流程,为蛋白纯化提供了新的思路。本研究使用Consensus fast Dna E（Cfa Dna E）断裂内含肽构建了亲和纯化系统。Cfa Dna E是一种人工构建的内含肽,具有快速剪接、高效表达、稳定性好等优点。但在研究过程中发现,内含肽的断裂需要外显肽辅助,需在外显肽N端插入CFN三肽,这对亲和纯化系统的实用性造成影响。本文对Cfa Dna E内含肽进行分子改造,减弱内含肽C端断裂反应对外显肽的依赖性。具体研究内容如下:（1）对Cfa Dna E内含肽进行分子改造。以本实验室保藏的p ET28a-IC-GFP为模板,进行分子改造。将Cfa Dna E内含肽121-123位,即IC20-22位的EKD突变为GEP,降低内含肽C端断裂对外显肽+2,+3位氨基酸的依赖性。（2）研究内含肽断裂反应对外显肽+2,+3位的依赖性。在IC与外显肽N端之间插入CGG三肽。对ICG-C-GFP进行断裂反应。发现Gly作为外显肽+2,+3位时,内含肽可以发生断裂反应,但断裂反应速度明显下降。证明改造后的内含肽摆脱了对外显肽+2,+3位的依赖性。（3）研究内含肽断裂反应对外显肽+1位的选择性。根据理论分析,认为内含肽C端断裂反应对外显肽+1位的依赖性应较低,故对其进行探究。在IC与外显肽N端之间插入Ser/Thr/Tyr/Gly/Met/Trp/Gln/Asn作为外显肽首位,两个Gly作为外显肽+2,+3位的三肽。对改造后的蛋白进行断裂反应,发现不同氨基酸作为外显肽首位时,内含肽的断裂速率也不同。其中,Asn无法使内含肽断裂,分析认为是Asn与内含肽末位Asn进行竞争,干扰了内含肽正常构象的形成。（4）对改造后的内含肽断裂反应条件进行优化。选用ICG-C-GFP为实验对象,优化了内含肽断裂反应的p H和温度条件。实验结果表明,内含肽断裂反应的最适p H为7.0,最适温度为37℃。（5）改造后的内含肽亲和纯化系统的应用。使用改造后的内含肽,在外显肽前3位为CGG的条件下进行纯化实验,成功纯化了纯度为95.68%的GFP,纯化倍数为4.14,回收率为29.50%。与未改造的内含肽亲和纯化系统相比,纯化效果接近,可以认为改造后的内含肽在小规模纯化上未受到外显肽改变的影响。
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