近年来，随着免疫力低下人群的增加，侵袭性真菌感染的发病率逐年上升。该病起病隐匿，临床早期无特异性体征，病情进展迅速，死亡率高，已遍布临床各科室，且抗真菌药物少，副作用大，诊断困难。因此，建立快速、特异、灵敏的检测方法，对于早期诊断、及时治疗，降低患者死亡率及改善预后至关重要。目前，侵袭性真菌感染的诊断方法主要为传统培养和组织病理学方法，但存在耗时长、阳性率低、有创伤性等缺点。以核酸为基础的分子生物学诊断方法因具有快速、特异和敏感的优势，在临床早期检测中具有广阔的应用前景。本研究针对侵袭性真菌感染的主要病原菌，建立了环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermal amplification, LAMP）和纳米金辅助半巢式PCR（semi-nested PCR,snPCR）检测方法。1. LAMP方法用于主要病原真菌的检测LAMP技术是一种简便、准确、廉价的核酸扩增方法，依赖于链置换酶（Bst酶）在恒温水浴锅条件下快速、高效的扩增核酸。该方法检测时间短、操作简单、设备要求低、结果易于观察。近十年来，LAMP技术被广泛应用于病毒、细菌及寄生虫等的诊断，但较少应用于真菌感染的诊断。本研究以ITS（internal transcribed spacer）为靶基因，分别设计了烟曲霉和假丝酵母属LAMP引物，建立了鉴定烟曲霉和假丝酵母属的LAMP方法。对反应温度、Mg2+浓度及Bst酶浓度等进行优化，确定了最佳反应体系。根据LAMP反应产生的特异性梯形条带可快速、特异的鉴定烟曲霉和假丝酵母属，其他常见病原菌未见扩增，灵敏度达pg级（烟曲霉6.0pg、假丝酵母属0.3pg），可在3h-4h内完成，高于常规PCR10倍。该方法灵敏度高、反应快速。另外，利用该方法对烟曲霉和白假丝酵母感染小鼠的血液、组织标本进行检测，检出率达70%-90%，较培养法高，可实现非培养标本的快速检测。2.纳米金辅助snPCR方法用于假丝酵母属的检测snPCR具有快速、特异、敏感等优点。本研究以GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）为靶基因，设计假丝酵母属特异性引物，建立了snPCR方法，用于鉴定假丝酵母属。但snPCR受引物、dNTP、模板DNA纯度等影响有时会出现非特异性扩增条带。本研究在snPCR体系中，加入了纳米金粒子（gold nanoparticles, AuNPs）。实验结果显示，加入4nM AuNPs（粒径13nm）后，仅有约360bp的目的条带产生，且其产量增加，表明AuNPs可消除非特异性条带扩增，增加目的条带产量。且与未加AuNPs的snPCR比较，该反应的灵敏度提高10倍，表明AuNPs可提高反应的扩增效率。利用该方法扩增临床假丝酵母属常见种，均可产生约360bp的特异性条带，其它临床常见病原菌未见扩增，检测灵敏度达30fg，并可在6h内完成。该方法可特异的鉴定假丝酵母属，灵敏度高、反应快速。另外，利用该方法检测白假丝酵母感染小鼠的血液、组织标本，检出率达80%-90%，明显高于培养法。综上所述，本研究针对烟曲霉和假丝酵母属，成功建立了LAMP和纳米金辅助snPCR方法。这两种方法可特异性的鉴定烟曲霉和假丝酵母属，灵敏度高，并均可实现非培养标本的快速检测，较培养法检出率高，检测时间短（可在3-6h内完成），为临床早期和痕量标本DNA的快速检测提供借鉴。