论文部分内容阅读
皮肤损伤后胶原蛋白等细胞外基质的异常沉积,可形成病理性瘢痕(增生性瘢痕或瘢痕疙瘩),不仅影响外表的完美,严重者可致功能为功能障碍。对病理性瘢痕的防治一直是临床研究的重要课题。瘢痕成纤维细胞是瘢痕形成过程中的关键效应细胞。成纤维细胞的异质性近来被认为是病理性瘢痕发病的重要机制。而转化生长因子β(TGFβ)是目前已知的与瘢痕形成关系最为密切的细胞因子。在体外实验中,TGFβ1可增加胶原、纤连蛋白、透明质酸等细胞外基质(ECM)的合成。合成的TGFβ1对瘢痕组织中Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因的表达起诱导调节作用。由于TGFβ1与瘢痕形成的关系密切,因此,抗TGFβ1治疗就有可能成为治疗瘢痕的有效途径。目前,关于病理性瘢痕的基因治疗已经开展了很多,许多学者尝试应用反义寡核苷酸、核酶的方法抑制TGFβ1的表达,但是,存在着转到效率低下,作用时间短暂缺点等。随着RNA干扰(RNA interference)现象的发现,为增生性瘢痕的基因治疗带来了新办法。RNA干扰是指外源性或内源性双链触发靶基因转录的同源序列mRNA特异地降解,从而产生相应功能缺失,这个过程属于转录后基因沉默(PTGS)。因其具有特异性、高效性持久性而得到应用。而应用RNA干扰技术治疗增生性瘢痕的研究,国内外报道的还很少。目的:通过载体介导的RNA干扰技术抑制TGFβ1的表达,以达到抑制瘢痕成纤维细胞的增殖,明确shRNA转染对细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达的影响。方法:根据siRNA设计原则,针对人TGFβ1基因序列特征构建特异性shRNA载体,转染增生性瘢痕培养的成纤维细胞;应用Real time RT-PCR,ELISA检测shRNA对TGFβ1基因及TGFβ1蛋白表达的抑制效果,同时MTT方法检测细胞增殖情况。ShRNA TGFβ1转染增生性瘢痕成纤维细胞,Real timeRT-PCR检测ShRNA TGFβ1转染后增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型及Ⅲ型胶原及Smads通路基因表达变化。结果:1.DNA载体介导的TGFβ1 pSUPER可以有效的抑制人增生性瘢痕成纤维细胞TGFβ1基因的表达;2.TGFβ1 pSUPER抑制人增生性瘢痕成纤维细胞TGFβ1基因的表达存在良好的时间、剂量依赖性;3.TGFβ1 pSUPER转染可有效抑制人增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ型胶原基因的表达;4.TGFβ1 pSUPER转染可有效抑制人增生性瘢痕成纤维细胞TGF/Smad信号通路下游转导分子Smad2、Smad3的表达;5.体外实验证实细胞转染特异性TGFβ1 pSUPER后细胞增殖受到明显抑制;结论:研究表明TGFβ1特异性shRNA能显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞TGFβ1表达,载体介导的TGFβ1特异性shRNA在增生性瘢痕中治疗的具有潜在的可能性。