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第一部分四妙丸含药血清对RA-FLS的作用的研究
目的
本研究通过研究四妙丸含药血清作用于类风湿关节炎的成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)，探讨四妙丸含药血清是否能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)通路达到抗炎、抗增殖作用。
方法
实验中类风湿关节炎患者的滑膜均由行关节镜、关节置换的病人捐赠。分离并培养RA-FLS原代细胞，MTT检测TNF-α和IL-1β对RA-FLS增殖的影响。制备不同浓度的四妙丸含药血清。四妙丸含药血清作用RA-FLS，MTT法检测RA-FLS增殖，Rt-PCR检测IL–6、TNF-αmRNA水平，Westernblotting检测MAPK/ERK信号通路蛋白表达。
结果
RA-FLS原代细胞在体外培养可正常传代8代以内。10ng/ml的IL-1β对RA-FLS有明显的促增殖作用。与正常鼠血清相比，不同浓度的四妙丸含药血清对RA-FLS的细胞增殖和IL–6、TNF-αmRNA水平和P-ERK蛋白水平无明显作用。
结论
四妙丸含药血清对RA-FLS的增殖和炎症因子分泌作用不明显。复方四妙丸体外实验的研究方法有待进一步探讨。
第二部分小檗碱对RA-FLS作用及机制的研究
目的
本研究通过研究小檗碱作用于类风湿关节炎的成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)，探讨小檗碱是否能通过LPA1(溶血磷脂酸受体1)达到抗增殖、抗炎及调节溶血磷脂酸(LPA)功能的作用。
方法
实验中的血液、滑液及滑膜均由门诊或行关节镜、关节置换的病人捐赠。检测RA、骨关节炎(OA)、健康对照血浆、滑液LPA水平及滑膜溶磷脂酸受体1(LPA1)的表达。从RA(n=4)患者的滑膜组织中分离原代成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)。不同剂量的小檗碱、LPA、和LPA1抑制剂(Ki16425)刺激RA-FLS，观察RA-FLS增殖、凋亡、炎症因子释放，检测LPA介导的MAPK信号通路ATX、LPA1、K-ras、c-Raf、P-p38、P-JNK和P-ERK1/2的表达水平。为了验证小檗碱能否通过LPA1调节LPA功能。首先，采用分子对接的方法预测小檗碱与目标蛋白LPA1的结合位点。然后小檗碱预处理RA-FLS后LPA作用24h，检测细胞的增殖、TNF-α、IL–6，ATX和MAPK信号通路蛋白；Ki16425预处理RA-FLS后小檗碱作用24h，检测细胞增殖、炎症因子分泌和ATX、MAPK信号通路蛋白。
结果
我们发现四妙丸君药黄柏的主要成分小檗碱对RA-FLS细胞增殖的抑制作用呈时间和浓度依赖性，并采用12.5、25μM的浓度作为抑制率的进一步实验剂量。与对照组相比，小檗碱能明显促进RA-FLS早期细胞凋亡，阻止细胞分裂，使细胞停止于G0/G1期；小檗碱能够明显下调RA-FLS的IL–6、TNF-α、k–rasmRNA、c-Raf、P-p38、P-ERK1/2MAPK信号通路蛋白的表达。RA患者血浆LPA(n=28)、滑液LPA水平(n=10)明显高于健康对照组(n=25)，RA患者血浆与膝关节炎滑液(RA-SF)中LPA水平无差异。与OA患者(n=4)相比，RA患者膝关节滑膜的(n=4)LPA1表达显著增强。RA患者血浆LPA水平与血小板水平呈正相关。小檗碱能下调RA-FLSATXmRNA的表达，但是对LPA1蛋白水平无明显影响。LPA可以促进细胞增殖，但是这种促增殖和促炎作用被小檗碱预处理抑制。LPA处理RA-FLS能明显促进TNF-α、IL–6、K-ras、c-Raf、P-p38、P-ERK1/2的表达,而小檗碱预处理后LPA的促炎、激活MAPK信号通路作用被抑制。根据分子对接，小檗碱可能通过两个氢键与LPA1的Lys39A结合，通过疏水作用力与Arg124A结合。Ki16425能够抑制细胞细胞增殖和炎症因子分泌，Ki16425预处理细胞后，小檗碱作用24h能明显增强抑制炎症效果。
结论
小檗碱通过下调p38/ERKMAPK信号通路抑制RA-FLS的增殖和炎症反应。我们的研究发现RA患者炎症状态下的血浆和关节滑液中的LPA水平明显升高，我们证明LPA对RA-FLS有促增殖和促炎作用。表明LPA在RA发病中起重要作用。进一步研究还发现小檗碱可以抑制ATX的表达，提示其可能具有降低LPA表达的作用。分子对接表明小檗碱可能与LPA1结合。小檗碱能逆转LPA诱导的促增殖、促炎和激活MAPK通路的现象表明，小檗碱可能通过结合LPA1调节LPA功能,表明其潜在调脂-抗炎作用，为临床药物开发提供能同时控制炎症和调整血脂异常的潜在药物。
第三部分四妙丸对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用研究
目的
间质性肺疾病(ILD)是类风湿关节炎(RA)的一种常见并发症。本研究探讨四妙丸对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用和可能的分子机制。
方法
将C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、四妙丸中剂量组(SM-M，4.26 g/kg/d)、四妙丸高剂量组(SM-H, 8.52 g/kg/d)(n=6)。在造模前三天每天给与四妙丸组药物灌胃，正常组和模型组给与等体积的生理盐水，造模当天戊巴比妥麻醉后以2.5mg/kg的博来霉素气道给药模型组及四妙丸组，制备小鼠肺纤维化模型。造模第二天继续灌胃干预，每周给药6天，造模初期每两天称量一次体重，后期每周两次体重评价，造模后第23天处死小鼠(造模后共给药22天)，眼眶取血、气管插管取肺泡灌洗液(BALF)、BALF细胞甩片进行刘氏染色、4%多聚甲醛灌流左肺后包埋进行H&E染色观察肺炎症浸润和肺损伤、天狼猩红和Masson染色检测胶原沉积、免疫组化法检测LPA1表达水平；碱水解法检测血清及BALF液羟脯氨酸(Hyp)浓度、ELISA法检测血清TNF-α和TGF-β浓度、ELISA法检测血清LPA、PLC、PKC浓度、检测血清和BALF中TNF-α、TGF-β1的表达水平，结扎左肺PBS缓冲液心脏灌流后冻存右肺组织，WesternBlotting法检测Jak2/P-Jak2，Jak3/P-Jak3，P-Stat3，Smad2/3，P-Smad2/3，α-SMA，P-ERK1/2的蛋白表达水平。
结果
造模后体重变化可以间接反映肺纤维化模型成模情况，造模后一周小鼠呈现明显的体重下降，表明模型初步建立。与空白对照组相比，模型组体重明显降低(P<0.001)；与模型组相比，SM-H体重明显增加(P<0.05)；模型组与SM-M组体重无显著性差异。SM能明显改善小鼠肺部和全身炎症。小鼠左肺横切面HE染色显示，模型组肺泡结构塌陷紊乱，肺泡间隔明显增厚伴炎性细胞浸润，与模型组相比，SM组肺部炎症评分和肺损伤明显轻微(P<0.001)，ELISA法检测小鼠血清和BALF中TNF-α浓度，与空白对照组相比，模型组血清中TNF-α浓度明显升高(P<0.001)；与模型组相比，SM组血清中TNF-α明显降低。与空白对照组相比，模型组BALF中TNF-α浓度明显升高(P<0.001)；与模型组相比，SM组BALF中TNF-α明显降低。与正常组相比，模型组和四妙丸组BALF中总细胞数均增多；与模型组相比，SM-H组BALF总细胞数明显减少(P<0.01)；与正常组相比，模型组巨噬细胞比例下降，但是巨噬细胞数量仍明显高于正常组；与模型组相比，SM-H组BALF中巨噬细胞比例升高，但是巨噬细胞数量仍明显低于模型组(P<0.05)。SM能明显改善小鼠肺纤维化。Masson染色和天狼星红染色显示，与正常组相比，模型组胶原沉积明显增多；与模型组相比，SM组胶原沉积较低、纤维化评分明显降低(P<0.01)；碱水解法检测肺组织中的羟脯氨酸含量，与空白对照组相比，模型组羟脯氨酸含量明显升高(P<0.001)；与模型组对照，SM组羟脯氨酸含量明显降低(P<0.05)。免疫荧光显示SM能抑制上皮间质转化。检测TGF-β/Smad通路蛋白显示，与正常对照组相比，模型组血清中TGF-β1明显升高；与模型组相比，四妙丸组血清中TGF-β1明显降低；有趣的是，BALF液中TGF-β1含量相反。与与正常对照组相比，模型组BALF中TGF-β1明显降低；与模型组相比，四妙丸组血清中TGF-β1有升高趋势。与正常对照组相比，模型组P-Smad2/3及P-Smad2/3和Smad2/3的比值均升高；与模型组相比，SM-H组P-Smad2/3及P-Smad2/3和Smad2/3的比值均降低。与空白对照组相比，模型组肺组织中P-STAT3表达量明显升高；与模型组相比，SM-M及SM-H组肺组织中P-STAT3表达量明显降低(P<0.05)；但P-JAK2表达量无统计学差异。采用免疫组化法检测LPA1，与空白对照组相比，模型组肺组织中LPA1蛋白相对表达量明显增多；与模型组相比，SM-H组LPA1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。与空白对照组相比，模型组血清中中PLC蛋白相对表达量明显降低；与模型组相比，SM-H组PLC蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。各组小鼠之间血清中LPA和PKC表达水平无显著差异。与空白对照组相比，模型组肺组织中P-ERK蛋白相对表达量明显增多；与模型组相比，SM-H组P-ERK蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。
结论
我们的研究发现SM能通过减轻小鼠肺部炎症和胶原沉积来改善博来霉素诱导的肺纤维化，且四妙丸高剂量组效果似乎更稳定，其治疗效果可能由于SM抑制了TGF-β/Smad、JAK2/STAT3、LPA/ERK/MAPK通路。体现了中药复方的多靶点治疗机制。由于各组小鼠血清LPA含量无统计学差异。由于缺乏LPA1基因敲除小鼠，SM是否能通过调节LPA来达到抗纤维化作用需要进一步探讨。
目的
本研究通过研究四妙丸含药血清作用于类风湿关节炎的成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)，探讨四妙丸含药血清是否能通过抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)通路达到抗炎、抗增殖作用。
方法
实验中类风湿关节炎患者的滑膜均由行关节镜、关节置换的病人捐赠。分离并培养RA-FLS原代细胞，MTT检测TNF-α和IL-1β对RA-FLS增殖的影响。制备不同浓度的四妙丸含药血清。四妙丸含药血清作用RA-FLS，MTT法检测RA-FLS增殖，Rt-PCR检测IL–6、TNF-αmRNA水平，Westernblotting检测MAPK/ERK信号通路蛋白表达。
结果
RA-FLS原代细胞在体外培养可正常传代8代以内。10ng/ml的IL-1β对RA-FLS有明显的促增殖作用。与正常鼠血清相比，不同浓度的四妙丸含药血清对RA-FLS的细胞增殖和IL–6、TNF-αmRNA水平和P-ERK蛋白水平无明显作用。
结论
四妙丸含药血清对RA-FLS的增殖和炎症因子分泌作用不明显。复方四妙丸体外实验的研究方法有待进一步探讨。
第二部分小檗碱对RA-FLS作用及机制的研究
目的
本研究通过研究小檗碱作用于类风湿关节炎的成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)，探讨小檗碱是否能通过LPA1(溶血磷脂酸受体1)达到抗增殖、抗炎及调节溶血磷脂酸(LPA)功能的作用。
方法
实验中的血液、滑液及滑膜均由门诊或行关节镜、关节置换的病人捐赠。检测RA、骨关节炎(OA)、健康对照血浆、滑液LPA水平及滑膜溶磷脂酸受体1(LPA1)的表达。从RA(n=4)患者的滑膜组织中分离原代成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)。不同剂量的小檗碱、LPA、和LPA1抑制剂(Ki16425)刺激RA-FLS，观察RA-FLS增殖、凋亡、炎症因子释放，检测LPA介导的MAPK信号通路ATX、LPA1、K-ras、c-Raf、P-p38、P-JNK和P-ERK1/2的表达水平。为了验证小檗碱能否通过LPA1调节LPA功能。首先，采用分子对接的方法预测小檗碱与目标蛋白LPA1的结合位点。然后小檗碱预处理RA-FLS后LPA作用24h，检测细胞的增殖、TNF-α、IL–6，ATX和MAPK信号通路蛋白；Ki16425预处理RA-FLS后小檗碱作用24h，检测细胞增殖、炎症因子分泌和ATX、MAPK信号通路蛋白。
结果
我们发现四妙丸君药黄柏的主要成分小檗碱对RA-FLS细胞增殖的抑制作用呈时间和浓度依赖性，并采用12.5、25μM的浓度作为抑制率的进一步实验剂量。与对照组相比，小檗碱能明显促进RA-FLS早期细胞凋亡，阻止细胞分裂，使细胞停止于G0/G1期；小檗碱能够明显下调RA-FLS的IL–6、TNF-α、k–rasmRNA、c-Raf、P-p38、P-ERK1/2MAPK信号通路蛋白的表达。RA患者血浆LPA(n=28)、滑液LPA水平(n=10)明显高于健康对照组(n=25)，RA患者血浆与膝关节炎滑液(RA-SF)中LPA水平无差异。与OA患者(n=4)相比，RA患者膝关节滑膜的(n=4)LPA1表达显著增强。RA患者血浆LPA水平与血小板水平呈正相关。小檗碱能下调RA-FLSATXmRNA的表达，但是对LPA1蛋白水平无明显影响。LPA可以促进细胞增殖，但是这种促增殖和促炎作用被小檗碱预处理抑制。LPA处理RA-FLS能明显促进TNF-α、IL–6、K-ras、c-Raf、P-p38、P-ERK1/2的表达,而小檗碱预处理后LPA的促炎、激活MAPK信号通路作用被抑制。根据分子对接，小檗碱可能通过两个氢键与LPA1的Lys39A结合，通过疏水作用力与Arg124A结合。Ki16425能够抑制细胞细胞增殖和炎症因子分泌，Ki16425预处理细胞后，小檗碱作用24h能明显增强抑制炎症效果。
结论
小檗碱通过下调p38/ERKMAPK信号通路抑制RA-FLS的增殖和炎症反应。我们的研究发现RA患者炎症状态下的血浆和关节滑液中的LPA水平明显升高，我们证明LPA对RA-FLS有促增殖和促炎作用。表明LPA在RA发病中起重要作用。进一步研究还发现小檗碱可以抑制ATX的表达，提示其可能具有降低LPA表达的作用。分子对接表明小檗碱可能与LPA1结合。小檗碱能逆转LPA诱导的促增殖、促炎和激活MAPK通路的现象表明，小檗碱可能通过结合LPA1调节LPA功能,表明其潜在调脂-抗炎作用，为临床药物开发提供能同时控制炎症和调整血脂异常的潜在药物。
第三部分四妙丸对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的作用研究
目的
间质性肺疾病(ILD)是类风湿关节炎(RA)的一种常见并发症。本研究探讨四妙丸对博来霉素诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用和可能的分子机制。
方法
将C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、四妙丸中剂量组(SM-M，4.26 g/kg/d)、四妙丸高剂量组(SM-H, 8.52 g/kg/d)(n=6)。在造模前三天每天给与四妙丸组药物灌胃，正常组和模型组给与等体积的生理盐水，造模当天戊巴比妥麻醉后以2.5mg/kg的博来霉素气道给药模型组及四妙丸组，制备小鼠肺纤维化模型。造模第二天继续灌胃干预，每周给药6天，造模初期每两天称量一次体重，后期每周两次体重评价，造模后第23天处死小鼠(造模后共给药22天)，眼眶取血、气管插管取肺泡灌洗液(BALF)、BALF细胞甩片进行刘氏染色、4%多聚甲醛灌流左肺后包埋进行H&E染色观察肺炎症浸润和肺损伤、天狼猩红和Masson染色检测胶原沉积、免疫组化法检测LPA1表达水平；碱水解法检测血清及BALF液羟脯氨酸(Hyp)浓度、ELISA法检测血清TNF-α和TGF-β浓度、ELISA法检测血清LPA、PLC、PKC浓度、检测血清和BALF中TNF-α、TGF-β1的表达水平，结扎左肺PBS缓冲液心脏灌流后冻存右肺组织，WesternBlotting法检测Jak2/P-Jak2，Jak3/P-Jak3，P-Stat3，Smad2/3，P-Smad2/3，α-SMA，P-ERK1/2的蛋白表达水平。
结果
造模后体重变化可以间接反映肺纤维化模型成模情况，造模后一周小鼠呈现明显的体重下降，表明模型初步建立。与空白对照组相比，模型组体重明显降低(P<0.001)；与模型组相比，SM-H体重明显增加(P<0.05)；模型组与SM-M组体重无显著性差异。SM能明显改善小鼠肺部和全身炎症。小鼠左肺横切面HE染色显示，模型组肺泡结构塌陷紊乱，肺泡间隔明显增厚伴炎性细胞浸润，与模型组相比，SM组肺部炎症评分和肺损伤明显轻微(P<0.001)，ELISA法检测小鼠血清和BALF中TNF-α浓度，与空白对照组相比，模型组血清中TNF-α浓度明显升高(P<0.001)；与模型组相比，SM组血清中TNF-α明显降低。与空白对照组相比，模型组BALF中TNF-α浓度明显升高(P<0.001)；与模型组相比，SM组BALF中TNF-α明显降低。与正常组相比，模型组和四妙丸组BALF中总细胞数均增多；与模型组相比，SM-H组BALF总细胞数明显减少(P<0.01)；与正常组相比，模型组巨噬细胞比例下降，但是巨噬细胞数量仍明显高于正常组；与模型组相比，SM-H组BALF中巨噬细胞比例升高，但是巨噬细胞数量仍明显低于模型组(P<0.05)。SM能明显改善小鼠肺纤维化。Masson染色和天狼星红染色显示，与正常组相比，模型组胶原沉积明显增多；与模型组相比，SM组胶原沉积较低、纤维化评分明显降低(P<0.01)；碱水解法检测肺组织中的羟脯氨酸含量，与空白对照组相比，模型组羟脯氨酸含量明显升高(P<0.001)；与模型组对照，SM组羟脯氨酸含量明显降低(P<0.05)。免疫荧光显示SM能抑制上皮间质转化。检测TGF-β/Smad通路蛋白显示，与正常对照组相比，模型组血清中TGF-β1明显升高；与模型组相比，四妙丸组血清中TGF-β1明显降低；有趣的是，BALF液中TGF-β1含量相反。与与正常对照组相比，模型组BALF中TGF-β1明显降低；与模型组相比，四妙丸组血清中TGF-β1有升高趋势。与正常对照组相比，模型组P-Smad2/3及P-Smad2/3和Smad2/3的比值均升高；与模型组相比，SM-H组P-Smad2/3及P-Smad2/3和Smad2/3的比值均降低。与空白对照组相比，模型组肺组织中P-STAT3表达量明显升高；与模型组相比，SM-M及SM-H组肺组织中P-STAT3表达量明显降低(P<0.05)；但P-JAK2表达量无统计学差异。采用免疫组化法检测LPA1，与空白对照组相比，模型组肺组织中LPA1蛋白相对表达量明显增多；与模型组相比，SM-H组LPA1蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。与空白对照组相比，模型组血清中中PLC蛋白相对表达量明显降低；与模型组相比，SM-H组PLC蛋白相对表达量明显升高(P<0.05)。各组小鼠之间血清中LPA和PKC表达水平无显著差异。与空白对照组相比，模型组肺组织中P-ERK蛋白相对表达量明显增多；与模型组相比，SM-H组P-ERK蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。
结论
我们的研究发现SM能通过减轻小鼠肺部炎症和胶原沉积来改善博来霉素诱导的肺纤维化，且四妙丸高剂量组效果似乎更稳定，其治疗效果可能由于SM抑制了TGF-β/Smad、JAK2/STAT3、LPA/ERK/MAPK通路。体现了中药复方的多靶点治疗机制。由于各组小鼠血清LPA含量无统计学差异。由于缺乏LPA1基因敲除小鼠，SM是否能通过调节LPA来达到抗纤维化作用需要进一步探讨。