环状RNA hsacirc0003449在胃癌中的表达及作用机制

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背景及目的:环状RNA(Circular RNA)是一种闭合环状结构的特别的非编码RNA。在最早被发现的时候,被认为是转录“噪声”的结果,但通过长时间的研究,发现它们参与了各种疾病的发生发展。其中,环状RNA在诊断和治疗肿瘤方面已经引起了医学界乃至其他领域的高度关注。胃癌有着极高的发生率,而且容易致死,胃癌发现时常常已经处于晚期,手术及放化疗的效果并不理想,所以寻找有效的早期诊断手段及治疗手段迫在眉睫。本研究在于探讨hsa_circ_0003449在胃癌中的临床价值及作用机制,为胃癌的诊断及治疗提供新的研讨思路。方法:1.采集2018年1月到2019年9月期间在江苏大学附属人民医院普外科住院行胃癌根治术的胃癌患者组织标本,按照要求筛出70例患者纳入本次研究,同时选取距离肿瘤组织5cm以上的癌旁组织作对照分析;另外,于2019年10月到2020年10月期间收集其中40例胃癌患者(未进行治疗干预)及5毫升健康体检者的外周血液标本。2.对胃癌组织及癌旁组织进行检测时引入高通量测序技术,并进行生信分析,筛选出环状RNA hsa_circ_0003449作为研究对象。对hsa_circ_0003449的环状结构进行验证时采用了琼脂糖凝胶电泳、RNA酶等方法。3.检测胃癌组织、外周血血清、癌旁组织中hsa_circ_0003449的含量时引入了q RT-PCR的方法,基于统计学方法对人体标本中hsa_circ_0003449的不同表现以及hsa_circ_0003449在健康志愿者及胃癌患者外周血中的差别进行了分析。4.运用mi Randa、targetscan等数据库与本实验组进行的高通量测序数据对何种mi RNA以及m RNA匹配hsa_circ_0003449进行预测;根据TCGA数据进行对比分析,明确后续研究对象——hsa_circ_0003449、mi R-661、m RNA TP73。5.采取q RT-PCR法检测hsa_circ_0003449在人正常胃上皮细胞株及人胃癌细胞株当中的表达水平,然后以人胃癌细胞含量较高的细胞株作为研究对象展开分析,在控制hsa_circ_0003449的含量方面,通过Si-circ_0003449对胃癌细胞株进行转染,所选对照组为空载体mi R-NC,以Si-circ_0003449+mi R-NC组、Si-circ_0003449+mi R-661 inhibitor组、Si-NC组作为实验分组,采用划痕实验、transwell、克隆形成实验来就hsa_circ_0003449对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响进行分析,Western blot检测上述分组的方式干预之后TP-73的含量的影响。结果:1.通过q RT-PCR检测环状RNA hsa_circ_0003449在胃癌组织和癌旁正常组织中的相对表达(n=70例),结果显示hsa_circ_0003449在患者胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织[(20.48±9.350)%vs(1.573±1.081)%,P<0.01]。胃癌患者(n=40例)血浆中的Hsa_circ_0003449表达水平明显高于正常健康志愿者[(4.079±1.764)%vs(0.3845±0.2322)%,P<0.01]2.通过q RT-PCR检测环状RNA hsa_circ_0003449在胃癌细胞(MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27)中的相对表达(P<0.01)。结果显示hsa_circ_0003449在HGC-27、MGC-803中的表达量较高。胃癌细胞(MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27)在si RNA干扰下,hsa_circ_0003449在MGC-803、HGC-27细胞株中的表达量明显下降,mi RNA-661在MGC-803、HGC-27细胞株中的表达量明显上升。3.对mi R-661进行下调能够对人胃癌细胞株因为hsa_circ_0003449含量的减少而不断弱化的侵袭、迁移、增殖能力进行逆转,下调mi R-661后,TP73蛋白表达量增多。结论:1.胃癌患者hsa_circ_0003449显著高表达。Hsa_circ_0003449很可能成为诊断胃癌的分子标志物。2.hsa_circ_0003449的含量得到控制之后,能够对人胃癌细胞株的迁移、增殖、侵袭的能力进行削弱,未来治疗胃癌的新靶点即hsa_circ_0003449。3.在ce RNA机制的作用下,hsa_circ_0003449会加速胃癌的发展,胃癌的发生发展会受到hsa_circ_0003449的影响。研究表明hsa_circ_0003449/mi R-661/TP-73轴在胃癌的发生发展中起到了重要的作用。
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