第一部分KDM6A对膀肢癌发生发展的影响及其机制的研究研究背景膀胱癌（bladdercancer）是泌尿系最常见的恶性肿瘤,2018年全球统计数据显示其发病率在所有恶性肿瘤中位列第10位。根据病理类型,膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer,MIBC）。NMIBC（临床分期为 Ta 或 T1）约占所有膀胱癌的75%,预后较好,5年生存率达90%;MIBC（T2-T4）约占25%,5年生存率约为60%,若出现淋巴结转移或远处转移预后更差。是否发生肌层浸润和远处转移对于膀胱癌病人的预后至关重要。因此,探究膀胱癌浸润转移的机制和寻找治疗靶点具有重要的临床价值。表观遗传学（epigenetics）指基因的表达水平发生变化而DNA碱基序列不变,最终发生表型改变,并且这种现象可以稳定遗传。其研究对象为表观遗传修饰,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等。基因组全外显子测序显示染色质重塑基因表达异常在膀胱癌中普遍存在,表明表观遗传学紊乱为膀胱癌的重要特征。在所有染色质重塑基因中,赖氨酸去甲基化酶6A（lysine demethylase 6A,KDM6A）在膀胱癌中突变率最高。KDM6A,又称为X染色体普遍转录的四肽重复序列（ubiquitously transcribed tetratricopeptiderepeat on X chromosome,UTX）,是一种组蛋白去甲基化酶,可特异性催化组蛋白H3第27位赖氨酸（H3K27）脱甲基。其功能与zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2,EZH2）相反,后者负责催化H3K27发生三甲基化（H3K27me3）,而启动子组蛋白形成H3K27me3为转录抑制的标志。此外,KDM6A可通过招募组蛋白乙酰化转移酶促使H3K27发生乙酰化,此过程不依赖其去甲基化酶活性。据报道,KDM6A在多数实体肿瘤中具有抑癌作用,如直肠癌、肾癌等。在膀胱癌中,KDM6A突变率高达30%,但其对膀胱癌的肌层浸润和远处转移的影响尚无详细研究。方法1.探究KDM6A在膀胱癌细胞和组织中的表达水平（1）细胞水平:利用Western blot检测KDM6A在不同分化程度的膀胱癌细胞系（RT4,T24,5637）和永生化膀胱上皮细胞系（SV-HUC-1）中的表达水平。（2）组织水平:利用免疫组织化学染色检测KDM6A在膀胱癌组织芯片中的表达水平,结合病人的临床病理参数进行分析,并探究其与病人预后的关系。2.KDM6A对于膀胱癌细胞增殖能力的影响（1）利用慢病毒感染和嘌呤霉素筛选,在3种膀肮癌细胞中分别过表达或敲除KDM6A,利用Western blot和RT-qPCR验证其表达效率。（2）通过MTT、克隆形成实验,检测KDM6A对于3种膀胱癌细胞增殖能力的影响。3.KDM6A对于膀胱癌细胞迁移浸润能力的影响（1）利用划痕实验和Transwell迁移实验,检测KDM6A对于T24、5637细胞迁移能力的影响;通过Transwell浸润实验,检测KDM6A对于膀胱癌细胞侵袭浸润能力的影响。（2）为了探究KDM6A在体内对于膀胱癌细胞浸润转移的影响,我们构建了裸鼠肿瘤肺转移模型。对裸鼠尾静脉注射稳筛的KDM6A过表达或敲除的膀胱癌细胞,4周后处死并解剖裸鼠,观察KDM6A对于肿瘤细胞肺转移的影响。（3）为探究KDM6A在膀胱癌中对上皮-间质转化过程的影响,利用RT-qPCR检测E-Cad、N-Cad、Snail、Zebl、Vimentin在KDM6A过表达或敲除膀胱癌细胞中的表达水平。4.探究KDM6A的下游调控机制（1）将KDM6A过表达和敲除的膀胱癌细胞及其各自对照细胞进行转录组测序,对表达变化的基因进行GO功能富集分析。（2）进一步分析转录组测序数据,根据表达倍数变化、基因功能和文献报道选择合适的靶基因进行研究。（3）通过Western blot和RT-qPCR,在膀胱癌细胞中检测KDM6A对于靶基因表达水平的影响。（4）利用免疫组织化学染色,检测靶蛋白在膀胱癌组织芯片中的表达水平,结合之前KDM6A的免疫组化染色结果,分析二者在组织中表达是否具有一致性。（5）为了探究KDM6A是否通过该靶基因影响膀胱癌细胞表型,在KDM6A过表达细胞中敲低靶基因的表达水平,观察对细胞表型是否具有拯救作用。（6）为了探究KDM6A调控靶基因表达的是否依赖其去甲基化酶活性,在膀胱癌细胞中加入去甲基化酶抑制剂或构建去甲基化酶结构域突变失活载体,观察对靶基因表达水平的影响。5.探究KDM6A上游调控机制（1）通过PCR获得KDM6A转录起始位点上游2000bp的启动子片段,将其构建于pGL3-Basic载体中。通过启动子截短实验和双荧光素酶实验,确定KDM6A核心启动区域。（2）利用生物信息学网站预测与核心启动区域结合的转录因子,构建转录因子过表达载体,结合双荧光素酶实验、启动子结合位点突变实验及染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation,CHIP）实验筛选对 KDM6A 核心启动区域具有调控作用的转录因子。（3）在膀胱癌细胞中利用siRNA敲低转录因子的表达水平,检测KDM6A及下游靶基因的RNA和蛋白水平变化。（4）在膀胱癌细胞中敲低转录因子的表达水平,检测细胞表型的改变。结果1.KDM6A在膀胱癌细胞和组织中的表达水平及其临床价值（1）Western blot结果显示,相较于永生化膀胱上皮细胞系（SV-HUC-1）,KDM6A在膀胱癌细胞系RT4、T24、5637中表达水平较低,其中5637细胞中表达水平最低。（2）膀胱癌组织芯片免疫组化结果显示,KDM6A高表达的肿瘤患者预后较好（P=0.008）,但其表达水平与肿瘤大小（P=0.580）、淋巴结转移（P=0.612）、肌层浸润（P=0.362）、TNM分期（P=0.705）无显著关系,并且KDM6A在膀胱癌和癌旁组织中的表达水平无差异（P=0.874）。2.KDM6A对于膀胱癌细胞增殖能力的影响具有细胞特异性（1）Western blot和RT-qPCR结果显示,与感染pLVX-IRES-Puro病毒的对照组细胞相比,感染pLVX-IRES-KDM6A病毒的细胞中KDM6A表达水平明显上调;与感染pLKO.l-Puro病毒的细胞相比,感染pLKO.1-shKDM6A病毒的细胞中KDM6A表达水平明显降低。（2）MTT和克隆形成实验结果表明,在RT4细胞中,过表达KDM6A显著降低其增殖活性和克隆形成能力;而在T24和5637细胞中,过表达或敲除KDM6A对于细胞增殖活性和克隆形成能力无显著影响。3.KDM6A抑制膀胱癌细胞的迁移浸润（1）划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,过表达KDM6A在体外明显抑制膀胱癌细胞的迁移和浸润能力,而敲除KDM6A则促进膀胱癌细胞的迁移浸润。（2）裸鼠肺成瘤实验结果显示,KDM6A过表达组裸鼠肺成瘤的数目显著低于对照组,而KDM6A敲除组裸鼠肺成瘤数目明显多于对照组,表明KDM6A在体内抑制膀肮癌细胞的浸润和转移。4.ARHGDIB为KDM6A的下游靶基因之一（1）转录组测序数据显示,KDM6A过表达组有1055个基因上调,834个基因下调;而KDM6A敲除组有1285个基因上调,715个基因下调。经过RT-qPCR验证,多数基因（33/42）的表达结果与测序结果相符。（2）根据测序结果,ARHGDIB在KDM6A过表达组上调38.3倍,在KDM6A敲除组下调14.7倍,变化显著。Western blot和RT-qPCR结果显示,与对照组细胞相比,KDM6A过表达的膀胱癌细胞中ARHGDIB表达水平明显上升,KDM6A敲除的细胞中ARHGDIB水平显著下降。组织芯片的免疫组化结果显示,ARHGDIB和KDM6A表达水平具有明显一致性。5.KDM6A通过下游ARHGDIB抑制膀胱癌的浸润转移（1）划痕愈合实验和Transwell实验结果显示,体外敲低ARHGDIB后膀胱癌细胞的迁移浸润能力明显上升。在KDM6A过表达细胞中,敲除ARHGDIB后膀胱癌细胞的迁移浸润能力得到恢复。（2）组织芯片的免疫组化结果显示,与KDM6A结果相同,ARHGDIB高表达的肿瘤患者预后较好（P=0.008）。6.KDM6A依赖去甲基化酶功能域调控ARHGDIB的表达（1）体外实验结果表明,KDM6A过表达的膀胱癌细胞中H3K27me3蛋白水平明显下降,而KDM6A敲除的细胞中H3K27me3水平上调。（2）KDM6A去甲基化酶功能域发生失活突变后,其对于ARHGDIB表达的促进作用基本消失。而且,使用去甲基化酶抑制剂GSKJ4处理后ARHGDIB表达水平降低,而敲除EZH2后ARHGDIB水平升高。（2）在裸鼠肺成瘤实验中,尾静脉注射KDM6A敲除组和对照组肿瘤细胞后,给予腹腔注射EZH2抑制剂GSK126可以明显降低KDM6A敲除组裸鼠肺成瘤的数目。（3）CHIP结果显示,KDM6A和H3K27me3在ARHGDIB的启动子区域有三个共同的结合区域。与对照组相比,在KDM6A过表达细胞中,该三个位点上KDM6A蛋白结合增多,H3K27me3结合减少。7.FOXA1在转录水平促进KDM6A的表达（1）荧光素酶实验结果显示,KDM6A转录起始位点上游-127bp至-71bp为KDM6A的核心启动子区域。JASPAR网站预测FOXA1、USF1、USF2和TFE3四个转录因子可以和该区域结合。将该四个转录因子分别过表达后,双荧光素酶实验结果表明只有FOXA1可增加KDM6A核心启动子区域的转录活性。将预测的FOXA1结合位点突变之后,过表达FOXA1对启动子活性的促进作用消失。CHIP结果表明,FOXA1直接结合在KDM6A的核心启动子区域。（2）体外实验结果表明,敲低FOXA1水平后KDM6A和ARHGDIB的RNA和蛋白水平均明显降低。8.FOXA1通过正向调控KDM6A和ARHGDIB的表达抑制膀胱癌细胞的迁移浸润（1）在膀胱癌细胞中敲低FOXA1表达水平后,膀胱癌细胞的迁移浸润能力明显提高。（2）在体外实验中,过表达KDM6A或ARHGDIB可显著抑制敲低FOXA1造成的细胞运动能力增强。结论本课题研究表明,KDM6A可通过其去甲基化酶功能正向调控ARHGDIB的表达水平,从而抑制膀胱癌的迁移和浸润。转录因子FOXA1可直接结合在KDM6A的启动子区域,促进KDM6A的转录表达。因此,FOXA1-KDM6A-ARHGDIB轴对于抑制膀胱癌细胞的浸润转移发挥重要作用。第二部分术前血小板分布宽度（PDW）对于膀胱肿瘤诊断价值的探究研究背景在全球范围内,膀胱癌发病率位列所有肿瘤第十位,死亡率位列第十四位。大多数膀胱癌为尿路上皮型,可分为非肌层浸润性（NMIBC;Ta,T1）和肌层浸润性（MIBC;T2-T4）,占比分别为75%和25%左右。NMIBC手术治疗后复发率高达60%-70%,并且大约20%NMIBC会进展为MIBC。经腹超声、膀胱镜和细胞学检查是诊断膀胱肿瘤的常规检查方法。由于复发率高,膀胱癌病人术后需要常规进行膀胱镜复查,复发后需要二次治疗,给病人造成较大经济负担。膀肮内翻性乳头状瘤属于良性肿瘤,约占膀胱肿瘤的1%-2%。因此,我们拟探寻鉴别膀胱肿瘤良恶性以及区分恶性程度的无创性检查方法。据文献报道,血小板在肿瘤发展和转移过程中发挥重要作用。血小板参数主要包括血小板计数（platelets,PLT）、平均血小板体积（mean platelet volume,MPV）、血小板分布宽度（platelet distribution width,PDW）、血小板压积（plateletcrit,PCT）等。MPV反映单个血小板的平均体积,PDW反映血小板容积的变异程度,PCT则反映单位体积的血液中血小板所占的体积比。研究表明,在多种肿瘤中存在血小板相关参数异常,如胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等。然而,目前尚无关于血小板参数与膀肮肿瘤鉴别诊断及预后的具体研究。方法研究对象和内容此回顾性研究收纳了 2016年1月至2018年6月在山东大学齐鲁医院泌尿外科接受治疗的210例膀胱癌患者和76例膀胱乳头状瘤患者,并纳入了 132例健康对照。研究内容包括性别、年龄、吸烟史、白细胞（WBC）计数、血小板相关参数、肿瘤相关参数等。统计学方法分析不同人群之间血小板参数等变量的差异使用Kruskal-Wallis检验和Nemenyi检验。连续变量资料之间的比较使用Student’s t检验或Mann-Whitney U检验。分类变量资料之间的比较使用卡方分析。受试者工作特征曲线（receiver-operating characteristic curve,ROC）和曲线下面积（areaunder the curve,AUC）用于评估PDW的诊断价值。Youden参数用于确定PDW的cut-off值。结果（1）血小板相关参数在各组之间的差异与对照组相比,膀胱癌和乳头状瘤患者的MPV和PCT水平显著升高,PDW水平显著降低。与膀胱乳头状瘤患者相比,膀胱癌患者的PDW水平进一步降低。PLT水平在三组之间无显著差异,MPV和PCT在膀胱癌和乳头状瘤患者之间亦无差异。（2）PDW对于膀胱肿瘤的鉴别诊断价值ROC分析结果表明,PDW对于鉴别膀胱癌和乳头状瘤的AUC为0.583（95%CI:0.507,0.659;P=0.033）,鉴别NMIBC和MIBC的AUC为0.612（95%CI:0.534,0.690;P=0.006）,鉴别高低级别膀胱癌的AUC为0.662（95%CI:0.588,0.736;P<0.001）,cut-off值分别为 11.25（灵敏度71.1%,特异度 42.4%）,11.95（灵敏度51.6%,特异度65.5%）,11.95（灵敏度59.6%,特异度66.1%）。（3）PDW和膀胱癌病人临床病理学参数的关系PDW降低与血小板计数升高（>223×109/L,P<0.001）、较大肿瘤体积（>3cm,P=0.029）、肿瘤高级别（P<0.001）、TNM高分期（P=0.018）、淋巴结转移阳性（P=0.048）、MIBC（P=0.003）、G分期高（P=0.022）相关。在MIBC人群中,PDW水平与淋巴结转移无显著相关性（P=0.125）。另外,PDW与膀胱癌患者的年龄、性别、吸烟史、白细胞数目、肿瘤多发性无显著关系。由于ROC曲线分析表明MIBC和NMIBC、低级别和高级别两组间的PDW cut-off值均为 11.95,我们利用此cut-off值将PDW分为PDW≤11.95（116/210,55.2%）和PDDW>11.95（94/210,44.8%）两组。肿瘤大小（P=0.042）、高低级别（P<0.001）、TNM分期（P=0.005）、T分期（P=0.004）、淋巴结转移（P=0.030）、肌层浸润（P=0.015）、G分期（P=0.004）在两组之间具有显著差异,而年龄、性别、吸烟史在两组间无差异。此外,PDW≤11.95与低MPV水平（P<0.001）、高血小板计数（P=0.002）显著相关。结论PDW可作为鉴别诊断膀胱癌和膀胱乳头状瘤的参考指标,并对膀胱癌恶性程度的判断具有重要价值。