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研究背景:胃癌(Gastric cancer,GC)是全球常见的恶性肿瘤,位居世界恶性肿瘤死亡率第3位。中国是世界胃癌高发国家,发病和死亡例数均约占世界的50%,疾病负荷严重,是癌症防治的重点。我国2015年肿瘤统计数据显示,在癌症发病率前五位中,男性胃癌发病率位列第二位,女性发病率位于第三位,男女性发病率比例约为2:1。尽管胃癌发病率和死亡率较前有所下降,但由于我国人口基数大和人口老龄化加剧的因素,死亡人数仍呈居高不下。虽然目前胃癌在早期筛查、手术、化放疗等多种治疗方法上取得明显的进步,但由于早期症状缺乏特异性,不易引起重视,一经诊治,大多数患者疾病已进展到晚期,故胃癌的总体生存率仍无明显提高,术后5年生存率仅为20%。因此,当前急需寻找一种新的特异性强、疗效显著且毒副作用小的治疗胃癌的药物。PD-0332991是新近发现的一种可口服的小分子化合物,具有特异性,能可逆的抑制细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(Cyclin-dependent kinase4/6,CDK4/6)的活性。已有研究数据表明,PD-0332991对子宫内膜癌、恶性胸膜间皮瘤细胞和肝细胞癌等多种恶性肿瘤具有显著的抑制作用。而且在2015年,美国食品与药品管理局(FDA)加速批准了 PD-0332991(IBRANCE(?),palbociclib)联合来曲唑(letrozole)可作为治疗雌激素受体阳性(ER’)和人表皮生长因子受体2阴性(HER-2-)绝经后转移性乳腺癌患者的一线治疗方案;随后又通过其联合氟维司群(fulvestrant)用于治疗激素受体阳性(HR+)和HER-2-的晚期或转移性乳腺癌。但是,关于PD-0332991对胃癌的抑制作用及相关机制的研究,鲜有报道。实验目的:本研究以常见5种胃癌细胞株为研究对象,来探讨CDK4/6抑制剂PD-0332991对胃癌细胞增殖的初步相关作用机制。实验方法:MTS 法筛选PD-0332991 对 5 个胃癌细胞株(MGC-803、HGC-27、BGC-823、SGC-7901和AGS)的敏感药物浓度。使用血气分析仪检测PD-0332991对以上胃癌细胞株就葡萄糖代谢相关指标,如葡萄糖(Glucose,Glu)、乳酸(Lactic acid,Lac)以及碱剩余(Base excess,BE)变化量的影响。使用全自动生化免疫分析仪检测PD-0332991对以上胃癌细胞株就肿瘤相关糖类抗原,如大分子糖蛋白抗原72-4(antigen72-4,CA72-4)、大分子糖蛋白抗原 12-5(antigenl2-5,CA12-5)、大分子糖蛋白抗原 19-9(antigen19-9,CA19-9)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA),人附睾蛋白4(Human epididymis protein 4,HE4)和胃泌素前体释放肽(pro-gastrin-releasing peptide,pro-GRP)分泌量的影响。使用 Annexin V-FITC/PI 双染结合流式细胞仪检测PD-0332991对以上胃癌细胞凋亡的影响。使用anti-PD-L1/PI双染结合流式细胞仪检测PD-0332991对胃癌细胞表面细胞程序式死亡-配体 1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)表达的影响。实验结果:使用不同浓度的PD-0332991(0-12 μM)作用48 h,MTS法检测发现PD-0332991 对 5 种人源胃癌细胞(MGC-803、HGC-27、BGC-823,SGC-7901 和AGS)均有明显的抑制作用,半数抑制浓度(IC50)依次为5μM、0.27μM、10μM,8 μM和6μM。使用血气分析仪检测PD-0332991对五种胃癌细胞就葡萄糖代谢相关指标(如Glu消耗量、Lac生成量及BE变化量)的影响,与对照组相比较,结果显示均无统计学意义。使用全自动生化免疫分析仪检测,发现PD-0332991对五种胃癌细胞相关肿瘤糖类抗原,如CA12-5、CA19-9、CA72-4、HE4,CEA和pro-GRP分泌量有不同的影响。对于MGC-803、HGC-27而言,PD-0332991对上述肿瘤糖类抗原分泌量均无影响。对于BGC-823而言,PD-0332991可使CA72-4和pro-GRP分泌量明显减少,即PD-0332991具有抑制分泌作用,且与药物浓度相关;对于SGC-7901和AGS来讲,PD-0332991可使CA12-5分泌量明显减少,即PD-0332991具有抑制分泌作用,与药物浓度无相关性。Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测发现PD-0332991可诱导MGC-803发生细胞凋亡,但与药物浓度无相关性;对于HGC-27,PD-0332991可诱导细胞凋亡,且呈浓度依赖性;对于BGC-823,PD-0332991不能诱导细胞发生凋亡;对于SGC-7901,PD-0332991可诱导细胞发生凋亡;对于AGS凋亡,PD-0332991则无明显影响。使用anti-PD-L1/PI双染结合流式细胞术检测发现,对于HGC-27,PD-0332991对PD-L1表达量无影响,且与浓度无相关性。对于MGC-803,PD-0332991可增加PD-L1的表达量,且与浓度无相关性。就SGC-7901而言,PD-0332991可明显增加PD-L1表达量,呈现出时间依赖性。对于AGS,PD-0332991对PD-L1表达量无明显影响,且与时间无相关性。实验结论:上述实验结果表明,PD-0332991对本研究所选用的5种胃癌细胞具有显著的生长抑制作用;但就葡萄糖代谢而言,PD-033 2 991对以上胃癌细胞均无明显影响;对于肿瘤糖类抗原分泌量而言,PD-0332991对于不同的胃癌细胞可呈现出不同的影响,详见上述实验结果部分;PD-0332991还可诱导部分胃癌细胞发生凋亡。此外,PD-0332991可促进胃癌细胞表面PD-L1的表达。总之,PD-0332991有望成为治疗胃癌的一个潜在药物,值得进一步临床验证。