论文部分内容阅读
BRK1蛋白是WAVE/SCAR五聚体复合物中的一个成员,参与激活Arp2/3复合体活性,Arp2/3促进微丝的核化和组装,进而使细胞形成伪足,获得运动能力。BRK1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织中的表达水平高于癌旁的正常组织,并且这种高水平表达与淋巴结转移、病理分级和分化程度都有显著相关。因此我们推测BRK1可能对非小细胞肺癌的转移具有促进作用。本研究以肺癌细胞A549,H1299和H520三株细胞为研究对象,旨在探寻BRKl在转录水平的调控机制,揭示肺癌组织中BRK1异常高表达的调控机理。利用转录因子预测软件TFsearch对BRK1基因ATG上游-84～-1nt区域(片段S831)进行分析,发现在-73～-64nt存在转录因子Sp1的潜在结合位点,序列为CTGGCAGCGC。将该位点后5位突变会导致S831片段在肺癌细胞A549,H1299和H520中的荧光素酶基因转录活性明显降低；同时Sp1的化学竞争抑制剂Mithramycin A也会明显抑制S831的转录活性。在Sp转录因子家族基因沉默实验中,将Sp1敲降会使BRK1的mRNA水平下降约30%以上,而对BRK1蛋白水平无明显影响；Sp1外源过表达对BRK1的表达没有明显影响。最后,电泳迁移率实验(EMSA)和染色质免疫共沉淀(ChIP)共同证明了Sp1能够结合于BRK1基因上游的启动子区。综上所述,本研究发现在非小细胞肺癌中,转录因子Sp1具有调节BRK1基因转录的作用,其结合位点位于BRK1基因上游-73～-64nt, Sp1的高水平可能是导致BRK1在非小细胞肺癌中表达上调的原因之一。染色体结构维持蛋白4(Structural maintenance of chromosome4, SMC4)是染色体ATP酶超家族的成员之一,与同族蛋白SMC2和其它非SMC亚基共同组成染色体集缩五聚体复合物condensin。Condensin在细胞有丝分裂过程中介导染色体的凝集和组装。表达谱芯片和免疫组化研究表明,SMC4在非小细胞肺癌肿瘤组织中较周围正常组织表达水平升高,而且肿瘤组织中SMC4基因高水平与肺腺癌患者临床预后显著相关,因此SMC4基因可能具有促进肺癌发生发展的作用。本研究以永生化支气管上皮细胞M细胞和肺癌细胞A549为研究对象,用免疫共沉淀和质谱技术寻找与SMC4相互作用的蛋白。在本研究中,我们发现SMC4在在细胞质和细胞核中有不同程度的分布。在SMC4免疫共沉淀结果中,考马斯亮蓝染色显示M细胞共有4条差异条带,A549共有2条差异条带,这些蛋白条带经液相色谱-串联质谱鉴定,共得到SMC4、SMC2、 NCAPG、NCAPD2、MCM5、IQGAP1、MAP4、MAP7、OPA1、CTNND1、DDX1、 DDX46、DIS3、HNRNPU、LRRFIP1、EEF2、PFKP、MTHFD1和ACLY20蛋白,功能主要涉及有丝分裂、细胞骨架组装、细胞粘附和RNA剪接过程等。表达谱芯片数据分析表明,SMC4、NCAPD2、NCAPG和MCM5在肺腺癌中都呈高表达,而IQGAP1在肺腺癌中表达明显下降,SMC4与SMC2、NCAPD2、NCAPG3个蛋白的表达量呈明显的正相关,相关系数R>0.65。最后选取了IQGAP1和MAP4两个蛋白进一步做SMC4的Co-IP-Western Blot验证。我们用Co-IP联合质谱初步鉴定出19个与SMC4有相互作用的蛋白,这些蛋白需进一步验证,本研究为寻找SMC4参与的分子网络提供线索。