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研究背景肝细胞癌是全球第五大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因。目前针对肝癌患者的治疗主要借助于手术切除、化疗药物治疗、放射治疗等。靶向血管内皮生长因子受体VEGFR的口服多激酶抑制剂索拉非尼（Sorafenib）是目前临床应用的抗肝癌一线药物,通过抑制VEGFR使肿瘤新生血管正常化可以增加免疫细胞对肿瘤的浸润。然而,索拉非尼只对大约30%的肝癌患者有益,而且通常在治疗半年内发生获得性耐药性,这严重阻碍了其临床有效性。自然杀伤（NK）细胞是肝脏天然免疫系统的重要组成部分,参与肝脏免疫防御和病理过程。在晚期肝癌患者中经常可以观察到NK细胞浸润减少、功能活性受损。临床上,肝细胞癌消融或切除后输注以NK细胞为主的细胞因子激活的自体淋巴细胞能改善患者生存期。细胞因子IL-15和靶向NKG2D配体的人源化抗体可以恢复肝癌患者NK细胞的功能。另外,短期应用索拉非尼可通过激活肿瘤相关巨噬细胞（TAM）来增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。由于原代NK细胞体外扩增技术的限制,NK细胞系成为NK细胞治疗和研究的有利工具。目前国际上已建立许多成熟的NK细胞系,包括NK-92、NKG、NKL、NK-YS、HANK-1、YTS和YT等。NK-92细胞系是目前在NK细胞中研究最为广泛的细胞系。NK-92细胞系从非霍奇金氏淋巴瘤男性患者体内分离得到,生长呈IL-2依赖性。与原代NK细胞相比,NK-92细胞系最大的优势在于其表面的抑制性受体（如KIR）表达很低,使得其对多种肿瘤的杀伤能力要优于原代NK细胞或者经细胞因子活化的其他杀伤细胞。NKL细胞系来源于CD3-CD16+CD56+大颗粒淋巴细胞白血病患者的外周血,生长也依赖于IL-2,具有自然杀伤活性和ADCC效应。NKL细胞系与NK-92细胞系的杀伤谱不完全一致,某些对NK-92不敏感的肿瘤细胞可以被NKL细胞有效杀伤,比如人胃癌细胞系。在肿瘤的生物治疗中可以作为NK-92细胞的补充,这也使得NKL细胞系成为过继免疫治疗的重要选择。化疗联合细胞治疗比单独化疗或单独细胞治疗的临床获益率更高,同时降低不良反应降低,增加机体对化疗的耐受性。鉴于上述研究,本研究通过慢病毒载体构建过表达hIL-15的NKL细胞,以提高NKL对肝癌细胞株的杀伤;同时,观察NKL-IL15细胞与化疗药索拉非尼联合应用治疗肝细胞癌的效应,探讨联合治疗的可行性。研究目的1.评价NKL-IL15细胞联合索拉非尼对肝癌细胞的治疗效果;2.初步探究NKL-IL15细胞联合索拉非尼对肝癌细胞的治疗机制;3.为临床肝癌治疗提供新的策略。研究方法1.通过qPCR技术从活化的人外周血单核细胞中扩增hIL-15片段,构建hIL-15的慢病毒载体;2.用病毒上清感染NKL细胞系,流式细胞术分选得到过表达hIL-15的NKL细胞系;3.通过qPCR和酶联免疫吸附实验检测NKL-IL15细胞表达hIL-15的水平;4.CCK8实验检测hIL-15基因修饰对NKL细胞杀伤作用的影响;5.CCK8实验检测索拉非尼对肝癌细胞Huh7和HepG2的剂量-反应曲线,计算IC50值;检测索拉非尼对NKL细胞与NKL-IL15细胞增殖的影响;测定NKL-IL15与索拉非尼联合应用对肝癌细胞系的杀伤效果;6.qPCR检测联合治疗后NKL/NKL-IL15细胞活化、杀伤相关基因和靶细胞凋亡相关基因mRNA变化;7.通过流式细胞术检测NKL/NKL-IL15细胞杀伤靶细胞后其活化、杀伤相关分子的表达水平;8.应用Western Blot检测联合治疗后肝癌细胞凋亡蛋白等表达水平的变化;9.人源肝癌细胞系HepG2对BALB/C/Nude小鼠进行腋下荷瘤,腹腔注射索拉非尼,并尾静脉注射NKL/NKL-IL15细胞进行联合治疗,检测肿瘤体积;TUNEL法检测肿瘤组织凋亡情况并用流式细胞术分析该联合治疗方案对于小鼠肿瘤中NKL/NKL-IL15细胞浸润状况的影响。研究结果1.hIL-15基因修饰NKL细胞系的构建经qPCR和酶联免疫吸附实验鉴定NKL-IL15细胞能够稳定表达hIL-15,流式细胞术检测NKL-IL15细胞阳性率在80%左右。2.NKL-IL15细胞对肝癌细胞的杀伤功能增强与未修饰的NKL细胞相比,NKL-IL15对肝癌细胞Huh7和HepG2的杀伤效果显著提高。3.索拉非尼对Huh7和HepG2细胞的IC50值根据索拉非尼处理Huh7和Hep G2肝癌细胞系48 h的剂量反应曲线,计算Huh7和HepG2细胞的IC50值分别为13 μM和5.9 μM。4.索拉非尼诱导肝癌细胞抗凋亡分子的表达5 μM和10 μM索拉非尼处理HCC细胞24 h,通过qPCR检测抗凋亡基因Mcl-1和Bcl-2的表达上调。5.低剂量索拉非尼对NKL/NKL-IL15细胞没有显著毒性5 μM和10μM索拉非尼处理NKL和NKL-IL15细胞24 h,当索拉非尼剂量小于5 μM时对NKL细胞和NKL-IL15细胞的存活能力没有明显影响。6.NKL-IL15细胞联合低剂量索拉非尼能抑制肝癌细胞的增殖qPCR显示,肝癌细胞暴露于5 μM索拉非尼48 h后,细胞干性和耐药性明显增强;CCK8实验显示,与单独NKL/NKL-IL15治疗相比,联合治疗效果更为明显;且与NKL细胞联合治疗相比,NKL-IL5细胞联合索拉非尼的杀伤效果更明显。7.低剂量索拉非尼通过改变肝癌细胞上清组成增强效应细胞的细胞毒作用低剂量索拉非尼处理HCC细胞24 h后,更换新鲜培养基,继续培养24 h后收HCC上清;将HCC上清与NKL/NKL-IL15细胞共孵育6h,qPCR和流式细胞术检测发现,低剂量索拉非尼处理的HCC上清可以上调NKL/NKL-IL15细胞活化性受体NKG2D及杀伤相关分子Perfrion、IFN-γ的表达。8.低剂量索拉非尼通过上调MICA增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性qPCR观察到,经索拉非尼处理并与效应细胞共孵育后的肝癌细胞中MICA表达有明显上调。进一步实验证实,索拉非尼通过下调肝癌细胞ADAM9总蛋白的表达,促进肝癌细胞膜MICA的表达,进而增强对NKL-IL15细胞的敏感性。9.NKL-IL15细胞与索拉非尼联合治疗抑制荷瘤小鼠肿瘤生长NKL细胞、NKL-IL15细胞与索拉非尼联合治疗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长,上调肿瘤部位NK细胞浸润比例,促进肿瘤细胞的凋亡。结论及意义1.体外实验表明,NKL-IL15细胞联合低剂量索拉非尼能显著抑制Huh7细胞和HepG2细胞的增殖,该过程与效应细胞活化和杀伤分子表达上调、Huh7细胞和HepG2细胞MICA表达上调有关;2.体内实验表明,NKL-IL15细胞联合低剂量索拉非尼能明显抑制肿瘤生长,并且与NKL细胞相比,NKL-IL15细胞在肿瘤内的浸润增加;3.本研究初步探索了 NKL-IL15细胞与化疗药索拉非尼联合治疗肝细胞癌的效果,为临床肝癌治疗提供了新的策略。