第一部分中国山东一个短指家系临床特征调查及其致病基因的定位和克隆短指(趾)(Brachydactylies，BDs)是一组以指(趾)畸形为主要特征的手(足)遗传病。1951年，Bell根据畸形发生部位和患者受累程度的不同，将遗传性短指畸形分为A、B、C、D、E五种类型。并将A型进一步细分为A1、A2、A3三种亚型。A1型短指最早是在1903年由Farabee在他的博士论文中描述的一种常染色体显性遗传病，这也是在人类中确定的第一种常染色体显性遗传病。1979年，Fitch对短指畸形进行了重新分类。根据Fitch的重新分类，A1亚型(Brachydactyly type A1，BDA1)的特征主要包括：患者所有指(趾)中节指骨短小、缺失或与远端指骨发生融合，拇指(趾)的近端指骨一般变短；有些个体的掌骨和跖骨也变短；有些家系患者还表现为身材矮小。部分患者会伴有肌肉骨骼的异常、脊柱侧凸、眼球震颤和发育迟缓等症状。2000年，Yang等通过对两个中国BDA1家系进行连锁分析，成功地将BDA1致病基因定位于2q35-2q36间8.1cM的区域内，对区域内的基因进行功能分析的结果提示Indian Hedgehog(IHH)基因有可能是BDA1的致病基因。2001年，Gao等在三个无血缘关系的中国BDA1大家系的患者中发现了IHH基因三个杂合错义突变，这些突变都位于IHH基因编码N-端功能区域内，从而确定IHH基因是BDA1的致病基因。但是，IHH基因错义突变并非导致BDA1的唯一致病基因。2002年，Armour发现一个加拿大A1型短指家系致病基因位于5p13.2-p13.3之间一个11cM区域内。2003年，Karkpatrick提出BDA1存在第三个致病基因位点，新致病基因位点的定位表明BDA1具有遗传异质性。我们在山东省济宁市发现了一个大的短指家系，临床特征分析和家系调查表明该家系中患者的表型特征符合典型BDA1。为确定该BDA1家系的致病基因，我们采用候选基因分析方法对该家系进行了基因定位和基因突变分析。一、家系调查该短指家系共有三代26名家系成员纳入到本研究中，包括14名患者和12名正常个体。根据知情同意原则，在征得所有家系成员同意后，所有受试对象测量身高，拍摄手、足部照片，由骨科医生进行体检，选择6个患者进行手、足部X-线照相，另对Ⅲ-3，Ⅲ-4进行全身各部位X-线照相。体检显示该家系中患者的异常仅限定于手、足部，患者的手短而宽，表现为所有的手指都缩短，部分患者的中指比食指和无名指还短。X-线照片显示，所有受检患者均有手、足部的骨骼异常，异常主要表现为中节指骨和掌骨(跖骨)的缩短。但是，表型的严重程度在家系内不同患者之间变化很大。Ⅲ-4是最严重的患者之一，他双手的中节指骨都缺失或与远端指骨发生融合，而且他双手的第三和第四掌骨均发生不同程度缩短。另一名患者Ⅲ-3的所有中节指骨也全部缺失或与远端指骨发生融合，掌骨同样发生缩短，但是她缩短的掌骨限定于第一和第三掌骨，同时，她的第一近端指骨也缩短。以前报道的BDA1患者中没有出现过严重的第一掌骨缩短，这是第一次发现第一掌骨和第一近端指骨同时缩短的BDA1患者。二、连锁分析与突变检测因为已知的BDA1基因位点分别位于2q35-2q36和5p13.2-p13.3区域，因此，我们首先从这两个区域内选择多态位点进行连锁分析。家系中各成员微卫星多态位点D5S1470的基因分型结果显示家系中患者携带不同的等位基因，表明本家系致病基因不在5p13.2-p13.3区域。利用所选择的IHH基因两侧微卫星多态位点对该家系患者进行基因型分析，各位点连锁分析结果显示致病基因与多态位点D2S2250、D2S433、D2S163和D2S2359紧密连锁，家系中所有患者都携带4-3-2-3单倍型；但对于DS2434位点，患者Ⅲ-13及其患病儿子Ⅳ-9携带等位基因3，而家系中其余患者携带等位基因4，提示D2S434与D2S2250之间发生了重组，致病基因位于D2S434下游。以上结果提示IHH基因是该BDA1家系的最佳候选基因。对该家系中一名患者(Ⅳ-3)与其正常的同胞兄弟(Ⅳ-2)IHH基因所有外显子和外显子／内含子接头序列进行PCR扩增，PCR产物的电泳结果显示IHH基因无大的插入和缺失突变发生。对PCR产物测序发现在IHH基因第一外显子第298位核苷酸发生了G→A杂合错义突变，这一突变导致IHH多肽链第100位的氨基酸由天冬氨酸转变为天冬酰胺(D100N)。为确定是否该突变在家系中与患者表型共分离，我们采用修饰引物引入酶切位点的聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性(ploymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)方法对该家系中的所有成员和100名正常中国人进行了IHH基因G298A基因型分析。酶切结果显示家系中所有正常个体的两个等位基因均被切开，是野生型等位基因的纯合子，而家系中所有患者只有一个等位基因被切开，是野生型和突变型等位基因的杂合子。对100名正常中国人200条染色体的分析没有发现298A等位基因存在。这些结果充分证明中国山东的短指家系患者是由于IHH基因G298A杂合突变所致。三、单倍型分析因为已经在6个白种人BDA1家系中发现了IHH基因G298A杂合错义突变，并且IHH基因G298A突变被认为可能是一个建立者突变。为确定本研究发现的BDA1家系是新发突变还是与白种人BDA1家系突变来源相同，我们选择4个与IHH基因紧密连锁的微卫星多态位点和IHH基因内5个SNPs位点构建了疾病相关单倍型(haplotype)，并与以前报道的Farabee-Drinkwater家系疾病相关单倍型进行了比较。结果显示在中国山东BDA1家系的单倍型和Farabee-Drinkwater家系单倍型之间有三个微卫星位点(D2S2250、D2S433和D2S163)和两个SNP位点(SNPe和SNPd)携带不同等位基因，由此可以认为中国山东BDA1家系的IHH基因G298A突变与白种人BDA1家系的IHH基因G298A突变具有不同的起源，IHH基因G298A突变可能发生过不只一次。综上所述，通过家系分析和临床调查，我们确定一个新发现的中国短指家系其表型属于A1型短指。通过连锁分析，我们排除了5p13.2-p13.3区域位点与本家系致病基因连锁，发现该家系致病基因位于2q35-2q36。候选基因分析结合突变检测发现IHH基因的G298A杂合错义突变导致该家系BDA1，并且利用疾病相关单倍型比较证实该家系中检测到的G298A突变是新发突变而非来自建立者突变(founder mutation)。对突变位点附近核苷酸序列分析发现，该突变可能是由于非编码链上5’ CpG 3’二核苷酸位点的5-甲基胞嘧啶容易发生自发的脱氨基作用所致突变热点效应造成的。作为IHH基因的一个突变热点，我们推测G298A杂合错义突变还会出现在其它BDA1家系中。第二部分Lrp5成骨作用相关基因筛选骨质疏松(osteoporosis)是以骨量减少、微结构异常为特征的、致使骨脆性增加而易于发生骨折的一种全身性代谢性疾病。骨质疏松是由于个体在生长发育时未能达到最佳峰值骨量(peak bone mass)和／或晚年骨量维持异常所造成的。骨量的维持是通过成骨细胞和破骨细胞共同作用的结果。低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low-density lipoprotein receptor related protein 5，LRP5)是细胞表面的受体蛋白，属于低密度脂蛋白受体家族，可通过与相应配体结合参与受体介导的细胞内吞作用而实现多方面的功能。研究表明LRP5基因的丧失功能突变导致骨质疏松—假性神经胶质瘤综合征，携带突变的杂合子个体骨密度显著低于正常对照，且易发生成年型骨质疏松，而LRP5基因的获得功能突变导致高骨密度和骨胳石化症(大理石样骨病)(osteosclerosis)。为理解LRP5在成骨细胞发生发展中的作用，本研究以小鼠骨髓基质细胞系ST2为实验对象，分别转染Lrp5基因获得功能突变(G171V)的表达载体和抑制Lrp5基因表达的Lrp5-RNAi表达载体，观察增强和抑制Lrp5基因功能对ST2细胞增殖和分化的影响；并在此基础上，采用抑制性消减杂交(SuppressionSubtractive Hybridization，SSH)技术，对比分析稳定表达获得功能突变Lrp5基因(G171V)和Lrp5-RNAi细胞的基因表达差异。取得了以下结果：一、Lrp5基因G171V获得功能突变表达载体构建与表达采用融合PCR技术对野生型Lrp5基因进行定点突变，通过片段置换构建带有Lrp5基因G171V获得功能突变的表达载体pcDNA3.1C-GFLrp5。经限制性内切酶酶切和测序证实。用pcDNA3.1C-GFLrp5表达载体转染ST2细胞，细胞免疫荧光技术和Western Blot技术证实pcDNA3.1C-GFLrp5可以在细胞内表达并与运输到细胞膜上发挥功能，同时通过共转染，证明mu6／LRP5表达载体可以有效抑制与其共转染的pcDNA3.1C-GFLrp5的表达，间接证明mu6／LRP5表达载体可以有效抑制细胞内源性Lrp5基因的表达。二、通过ST2细胞增殖能力和von Kossa染色实验确定两种表达载体的作用效果ST2是小鼠骨髓基质细胞来源的细胞系，具有多向分化的潜能，在有β-甘油磷酸钠存在的条件下，L-抗坏血酸可以诱导ST2细胞向成骨细胞样细胞分化。ST2细胞分别转染pcDNA3.1C-GFLrp5表达载体与抑制Lrp5基因的RNAi表达载体mu6／LRP5后，经过G418筛选稳定转染的细胞分别标记为S-LGF和S-LLF。MTT法检测S-LGF和S-LLF细胞增殖能力的结果表明，细胞接种后24小时、48小时和72小时三个时间点，S-LGF的细胞增值能力都显著高于S-LLF细胞，表明Lrp5基因G171V获得功能突变对ST2细胞的增殖能力具有很强的促进作用。对向成骨细胞诱导分化培养28天的S-LGF和S-LLF细胞进行von Kossa染色，结果显示S-LGF细胞比S-LLF细胞可以更早、形成更多、染色更深的骨样结节。对连续培养达到40天的S-LGF和S-LLF细胞进行von Kossa染色的结果差别更加明显，表明与对细胞内的Lrp5基因表达进行抑制相比，向细胞内转染Lrp5基因G171V获得功能突变对ST2细胞向成骨细胞分化和增殖能力都有明显促进作用。三、S-LGF和S-LLF细胞消减cDNA文库的构建及筛选为分离和鉴定Lrp5成骨相关基因，我们采用抑制性消减杂交技术，以S-LGF细胞的mRNA为实验方、S-LLF细胞的mRNA为驱动方构建了正向消减cDNA文库，同时以S-LLF细胞的mRNA为实验方、S-LGF细胞的mRNA为驱动方构建了反向消减cDNA文库。利用菌液做模板进行PCR扩增，我们对构建的正向和反向消减cDNA文库进行了筛选。在随机选择的各200个克隆中，从正向消减cDNA文库中筛选出105个有插入片段的克隆，从反向消减cDNA文库中筛选出97个有插入片段的克隆，结合不同限制性内切酶的酶切图谱，选择正向消减cDNA文库的60个克隆和反向消减cDNA文库的61个克隆进行测序。四、cDNA测序与同源性分析初步结果将测序结果与GenBank中的核酸序列比较后获得了在S-LGF中差异表达的cDNA片段51个，其中已知基因44个，RIKEN cDNA基因3，另有4个片段在GenBank中无对应的已知基因，可能为新基因。在S-LLF细胞中差异表达的cDNA片段58个，其中已知基因43个，RIKEN cDNA基因8个，另有7个片段在GenBank中无对应的已知基因，可能为新基因。下一步我们将在证实这些基因差异表达的基础上进一步分析这些基因在成骨细胞发生发展中的作用。