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背景和目的： 食管癌是世界上最常见的八大恶性肿瘤之一，我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，主要以食管鳞状细胞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）为主。由于多方面的原因，食管癌患者确诊时往往已到中晚期，失去手术治疗机会，尤其是对于局部晚期的食管癌患者，放射治疗成为主要的治疗手段之一。然而，放射治疗的最大障碍在于肿瘤细胞存在放疗抵抗，而放疗抵抗被认为是肿瘤局部复发或放疗失败的重要原因。由于食管癌的病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常，而这些基因以及基因表达蛋白的改变有许多与放疗敏感性相关。受体型蛋白酪氨酸磷酸酶O（proteintyrosinephosphatasereceptortypeO，PTPRO）是受体型蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员，已经发现在多种肿瘤中发挥抑癌基因功能。本实验室前期研究结果表明，ESCC原发肿瘤组织中PTPRO的甲基化频率为75％（27/36），启动子甲基化所致的PTPRO表达沉默与ESCC的浸润程度和TNM分期显著相关，提示PTPRO的表达沉默可能参与ESCC的发生发展过程，可能与患者的预后有关。本实验在前期研究的基础上，主要在ESCC细胞水平研究过表达PTPRO对ESCC细胞恶性生物学行为的影响，以及对ESCC细胞的放射敏感性的影响，并初步探讨影响其放疗敏感性的机制。 方法： 1.构建pCR-PTPRO-HA真核表达载体。 2.重组质粒的扩增和纯化。 3.建立过表达PTPRO的食管癌细胞系，以及转染空载体后不表达PTPRO的食管癌细胞系，通过RT-PCR和westernblot实验进行验证。 4.应用MTT比色法、平板克隆形成实验以及软琼脂克隆形成实验检测过表达PTPRO对TE1细胞活力的影响。 5.分别给予过表达PTPRO组、空载体转染组细胞不同剂量（0、1、2、4、6Gy）X线照射后，应用平板克隆形成实验检测PTPRO转染食管癌细胞后的放射增敏作用。 6.通过流式细胞仪（FCM）分析，PTPRO转染TE1细胞后对细胞周期分布的影响。 结果： 1.通过双酶切以及测序证实已经成功构建pCR-PTPRO-HA真核表达载体。 2.重组表达载体pCR-PTPRO-HA及对照空载体pCR-HA分别转染TE1细胞，以300μg/ml的G418浓度进行筛选，2周后得到阳性混合克隆，建立外源过表达PTPRO蛋白的稳定转染细胞系，扩大培养后通过RT-PCR、Westernblot实验检测PTPRO的表达状态，实验证实成功建立了稳定表达PTPRO的2株抗性克隆细胞系（TE1-PTPROc1与TE1-PTPROc2），以及不表达外源性PTPRO的空载体转染组（TE1-vector）。 3.过表达PTPRO对TE1细胞活力的影响：经MTT比色法测定并绘制细胞生长曲线表明，过表达PTPRO的2株抗性克隆细胞株TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2与空载体转染组（TE1-vector）及未转染对照组（TE1）相比其增殖能力显著减弱（P<0.05）；经平板克隆形成实验证实，重组表达载体pCR-PTPRO-HA以及pCR-HA瞬时转染TE1细胞后，与空载体转染组相比较，PTPRO转染组其平板克隆形成能力明显下降，其差异具有统计学意义（P<0.05）；经软琼脂克隆形成实验证实，与空载体转染组（TE1-vector）及未转染对照组（TE1）相比，过表达TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2组在软琼脂中的克隆形成数明显减少，其差异具有统计学意义（P<0.05）。 4.过表达PTPRO对TE1细胞放射敏感性的影响：TE1-vector、TE1、TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2分别经X线照射后的2Gy剂量照射后存活分数(Survivalfractionat2Gy，SF2)分别为0.57±0.003、0.56±0.003、0.38±0.006、0.34±0.009，TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2组SF2值均较TE1-vector组低，经统计后其差异具有统计学意义（P<0.01），且TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2组的SF2<0.4，提示PTPRO转染TE1细胞后能够增加其内在放射敏感性。另外，TE1-vector、TE1、TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2分别经X线照射后其半数抑制剂量（thehalfinhibitorydosage，ID50）值分别为2.11±0.03、2.16±0.01、1.42±0.02、1.46±0.02，TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2组ID50值均较TE1-vector组低，经统计后其差异具有统计学意义（P<0.01），进一步提示PTPRO转染TE1细胞后能够增强放射敏感性。 5.通过流式细胞仪（FCM）分析PTPRO转染TE1细胞后对细胞周期分布的影响：结果表明，TE1-PTPROc1、TE1-PTPROc2组较TE1-vector组细胞G2/M、G0/G1期所占比例均增加(P<0.05)，S期的比例减少（P<0.05），其差异具有统计学意义，提示PTPRO转染TE1细胞后能够增强放射敏感性，其作用机制可能是由于PTPRO转染TE1细胞后导致细胞周期的再分布所致。 结论： 1.PTPRO转染ESCC细胞系TE1后，其增殖能力、克隆形成能力、非锚着依赖性生长能力显著减弱，进一步在细胞水平验证了PTPRO在食管鳞状细胞癌中符合潜在抑癌基因的基本特征，也为进一步探索食管癌的发生发展以及治疗靶点提供新的方向。 2.PTPRO转染ESCC细胞TE1后其放射敏感性增强，可能与细胞周期再分布有关。